Приготування поживного середовища для вирощування продуцента

Джерела азоту.Для розвитку стрептоміцетами і біосинтезу митомицина в синтетичних середовищах найбільш сприятливі амонійні солі. Нітрати як єдиних джерел азоту продуцентом митомицина не використовуються, але при додаванні до середовища кукурудзяного екстракту стрептоміцетами починає їх споживати. Мабуть, неможливість використання стрептоміцетами нітратів пов'язана з відсутністю у нього донорів водню.

Натомість присутність нітрату натрію в середовищі, що містить кукурудзяний екстракт, призводить до зміни всього процесу обміну речовин стрептоміцетами. Так, концентрація КN03, рівна 0,25 %, перешкоджає залученню в обмін речовин стрептоміцетами молочної кислоти , що знаходиться в кукурудзяному екстракті; при 0,5% КN0з кислота споживається, а при 1 % - вона не тільки використовується організмом, а й утворюється їм знову.

Джерела вуглецю.Найкращим джерелом вуглецю для розвитку S. caespitosus та освіти антибіотика, за даними більшості авторів, вважається глюкоза. Стрептоміцетами добре росте в середовищах з глюкозою, фруктозою, галактозою, ксилозою, мальтозою, лактозою або крохмалем, але не росте в середовищах з арабінозою, рамнозою, сахарозою, рафіноза, сорбітом, дульцітом.

Майже всі штами, що утворюють мітоміцін, можуть використовувати тваринні жири, рослинні масла або жирні кислоти (олеїнова, пальмітинова) в середовищах, що не містять глюкозу. Масла сприяють збільшенню біомаси стрептоміцетами, прискорюють споживання джерел азоту і разом з тим уповільнюють використання глюкози. Вплив масел залежить насамперед від виду масла, складу середовища і штаму стрептоміцетами. Шлях використання масла стрептоміцетами, мабуть, той же, що і для інших організмів: гідроліз до гліцерину і жирних кислот з подальшим р- окисленням їх.

Спирти, за винятком маннита і гліцерину, непридатні для зростання стрептоміцетами та синтезу антибіотика.

З органічних кислот молочна, піровиноградна і лимонна в синтетичних середовищах стимулюють утворення митомицина. Використання суміші яблучної та янтарної кислот в середовищі, що містить основні амінокислоти, сприяє значному збільшенню продукування антибіотика.

Джерела мінерального живлення та їх роль в процесі біосинтезу мітоміцина.Життєдіяльність продуцента митомицина і його біосинтетична активність забезпечуються наявністю в середовищі таких компонентів, як фосфор, залізо, кальцій та інші мінеральні речовини.

Фосфор.Фосфор має важливе значення в розвитку S. caespitosus та освіті антибіотика.

Збільшення концентрації фосфору в середовищі до певної межі підсилює вироблення митомицина, подальше ж підвищення вмісту фосфору, не надаючи помітного впливу на ріст міцелію, знижує утворення антибіотика. Надлишок фосфору в середовищі впливає на біохімічний склад цитоплазми, змінює цикл розвитку стрептоміцетами і порушує деякі фізіологічні функції клітин .

Значне збільшення вмісту неорганічного джерела фосфору прискорює споживання вуглеводів і пригнічує розвиток стрептоміцетами, а отже, і вироблення мітоміцина.

При надлишку фосфору в середовищі, що містить глюкозу, збільшується накопичення піровиноградної кислоти, але такої закономірності не спостерігається у випадку використання крохмалю.

Споживання фосфору стретоміцетом в більшій мірі залежить від вихідної концентрації цього елемента в субстраті. Так, на середовищі з вихідною кількістю фосфору, рівним 29 мкг/мл, до 48-ї години споживається 21 мкг/мл, а при початковій концентрації, равної 128 мкг/мл, кількість спожитого фосфору зростає до 118 мкг/мл за той же період. Ці дані вказують на те, що залежно від початкової концентрації фосфору в середовищі істотно змінюється якість виріс міцелію стрептоміцетами, а отже, і умови утворення мітоміцина.

Зміни у вуглеводному і фосфорному харчуванні, в свою чергу, викликають зміни в нуклеїновому обміні культури і в загальному процесі розвитку продуцента.

Оптимальний вміст фосфору, рівне 0,04-0,07 мг / мл, сприяє хорошому зростанню і розвитку стрептоміцетами і високому рівню біосинтезу митомицина. Однак найбільш сприятлива для зростання продуцента та освіти митомицина концентрація фосфору в середовищі залежить від штаму стрептоміцетами, складу середовища і способу її приготування.

Залізо, цинк, мідь, магній. Важливе значення в процесі розвитку S. caespitosus та освіти антибіотика мають такі елементи, як залізо, цинк, мідь, магній та ін.

Максимальний вихід митомицина спостерігається за умови утримання FeS04•7Н20 в середовищі в кількості 0,01-0,02 %. Збільшення концентрації сірчанокислого заліза до 0,05 % призводить до придушення біосинтезу антибіотика, зниження швидкості споживання вуглеводів і до затримки розвитку стрептоміцетами. Додавання відповідної кількості фосфору до середовища з надлишком заліза знімає несприятливу дію іонів заліза на біосинтез митомицина. Ймовірно, негативний ефект від надлишку заліза в середовищі визначається тим, що він зв'язує іони фосфору. Іони магнію відіграють важливу роль в азотному обміні актиномицета, а також в реакціях фосфорилювання.

Що стосується міді, то роль цього елемента в життєдіяльності продуцента митомицина та освіті антибіотика не цілком ясна. Однак відомо, що збільшення концентрації міді до 50 мг% істотно не впливає на утворення митомицина, але пригнічує ріст стрептоміцетами.

Збільшення концентрації цинку і заліза до 50 мг% сильно пригнічує утворення митомицина (до 50% в порівнянні з контролем).

Хлорид натрію. До складу всіх середовищ, що використовуються для утворення митомицина, входить хлорид натрію NaС1. Було відмічено, що без кухонної солі антибіотична активність культуральної рідини нижче активності цієї рідини, що містить NaС1.

У присутності хлориду натрію збільшується проникність клітинної стінки і мітоміцін легше переходить у навколишнє середовище. Утворений мітоміцін неповністю виділяється у середу: певна частина його міцно пов'язана з клітинними стінками міцелію стрептоміцетами і може бути витягнута при обробці міцелію кислотою, лугом або сіллю.

Для з'ясування ролі кухонної солі в процесі біосинтезу митомицина були проведені досліди з вирощування S. caespitosus на середовищах з хлоридом натрію і без нього, які показали , що вміст антибіотика дійсно трохи вище в середовищі з NaС1. Однак при кислотної обробці міцелію в цілях витягання пов'язаного митомицина виявилося, що загальний вихід антибіотика вище на середовищі, що не містить NaС1.

Отже, наявність хлориду натрію в середовищі не сприяє біосинтезу митомицина, а лише полегшує виділення утворився антибіотика з міцелію в середу.

Кальцій.Як елемент мінерального живлення кальцій сам по собі не робить істотного впливу на біосинтез митомицина, однак у залежності від складу середовища він може грати позитивну або негативну роль. Так, при стерилізації середовищ, що містять фосфати, в присутності іонів кальцію звичайно іони фосфорної кислоти зв'язуються з кальцієм у вигляді нерозчинних сполук. Якщо в середовищі фосфор знаходиться в обмеженій кількості, це знижує біосинтез митомицина, але при використанні середовищ з надмірним вмістом фосфатів внесення кальцієвих солей перед стерилізацією може перевести частину фосфору в нерозчинні кальцієві сполуки, тобто створяться умови, сприятливі для біосинтезу антибіотика.

Крім того, іони кальцію і магнію регулюють значення рН середовища при підкисленні її за рахунок залишків сірчаної, фосфорної або інших мінеральних кислот при використанні амонійних солей, наприклад (МН₄) 2НР0₄.

Іони Са²⁺ активують такі ферменти, як ліпази, адено-зінтріфосфатази і деякі інші. Вони можуть також інгібувати функції ферментів, що активуються магнієм.

Температура.У розвитку стрептоміцетами і біосинтезі митомицина велике значення має температура культивування організму. Підвищення температури вище 30 ° С практично припиняє утворення антибіотика. Межі оптимуму температури для синтезу антибіотика визначаються 27-29 ° С.

рН середи.Кращим початковим рН середовища для розвитку стрептоміцетами є рН 7,0. Стрептоміцин утворюється при значенні рН, що знаходиться між 6,8-7,2.

Аерація.S. caespitosus — організм високоаеробний, він поглинає значну кількість кисню, яка залежить від складу середовища та стадії його розвитку.

У ранній період розвитку стрептоміцетами споживання кисню повітря відбувається інтенсивно, а потім падає майже до нуля. Збільшення ступеня аерації підвищує вихід митомицина. Метаболізм у молодого і старого міцелію стрептоміцетами різний.

Молодий міцелій S. caespitosus містить, як правило, в 2-3 рази більше нуклеїнових кислот, чим більш старий міцелій.

При збільшенні аерації культури підвищується значення рН середовища, тобто швидше руйнуються протеїни.