Стерилізація поживних середовищ

Для мітоміцину С розробляється оптимальне живильне середовище. Середа повинна відповідати наступним вимогам: а) забезпечувати максимальний вихід антибіотику б) складатися з відносно дешевих компонентів в) мати хорошу фільтруючу здатність г) обеспечи застосування найбільш економічних прийомів виділення і очищення мітоміну С.

Стерилізація живильних середовищ в промислових умовах здійснюється двома основними методами: періодичним і безперервним.

Періодичний метод стерилізації застосовується при неналежного використання невеликих обсягів середовища і полягає в тому, що середовище нагрівають до температури 120-130° С безпосередньо в ферментерах або в спеціальних котлах - стерилізаторах, витримується при цій температурі протягом 30-60 хв (залежно від обсягів середовища та її складу), після чого охолоджується до 27-30° С.

За час, що витрачається на нагрівання середовища до температури, що необхідна для стерилізації, і її охолодження, в ній знищуючи мікроорганізми. Відомо, що для нагрівання до температури стерилізації великих обсягів середовища і потім для її охолодження потрібно більше часу, ніж для маленьких обсягів, тому час, що витрачається на підтримання найбільш високою стерилизующей температури у великих обсягах, може бути меншим, ніж для невеликих обсягів з тим же ефектом стерилізації.

Ефект стерилізації та збереження термолабільних речовин середовища досягаються в тому випадку, якщо стерилізацію проводять при більш високій температурі і за більш короткий час.

Безперервний метод стерилізації доцільно застосовувати при використанні великих обсягів середовища . Приготована середу з спеціальної посудини за допомогою насоса направляється в стерилізаційну колонку, через яку пропускають гостру пару (тиск пари близько 505 Па). Пар подають зверху по внутрішній трубі, що має щілиноподібні прорізи, завдяки чому він поступає в середу, швидко її нагріваючи. Середа в колонку надходить знизу і рухається по спіралі навколо внутрішньої труби. Середа, нагріта в колонці до необхідної для стерилізації температури (близько 130° С), надходить у спеціальний апарат, де вона витримується певний час при температурі 125-130° С. Час витримки залежить від складу середовища і триває 5-10 хв. Відсюди стерильна середу подається в змієвиковий холодильник, охолоджують до 30-35° С (на виході) і надходить у ферментер.

Безперервний метод стерилізації має ряд переваг: можливість автоматичного регулювання процесу, швидкий і рівномірний нагрів середовища , забезпечення більш повної стерильності середовища та ін.

При застосуванні як окремих компонентів субстратів та термолабільних речовин їх, як правило, слід стерилізують окремо в умовах більш м'якого режиму.

Стерилізація апаратури.

У біотехнології найбільшого поширення набула термічна стерилізація. У технічних системах, що працюють в асептичних умовах, повинна забезпечуватися стерілізуемую усіх точок внутрішніх обсягів апаратів, комунікацій, арматури, контрольно-вимірювальних приладів, що безпосередньо стикаються з чистими культурами цільових мікроорганізмів або зі стерильними матеріальними потоками. Для цього в кожній точці необхідно створити необхідну температуру і підтримувати її протягом заданого проміжку часу.

Найбільшим бактерицидну ефектом володіє насичений водяний пар під тиском. При стерилізації насиченою водяною парою суперечки найбільш стійких термофілів гинуть при температурі 121° С і часу експозиції 25 хв, при 132° С - за 4 хв. При використанні сухого пара час загибелі суперечка становить при 160° С - 60 хв., А при 180° С - 10 хв. Інактивація спор в киплячій воді при 100° С відбувається повільно, вони гинуть через 8-9 годин. Велике значення має вміст води в клітині мікроорганізму - чим більше води, тим нижче температура коагуляції білків. Саме цим пояснюється високий стерилізуючий ефект насиченої водяної пари - він не тільки нагріває, але і зволожує клітини, що підвищує термочутливість.

Стерилізацію рідких поживних середовищ при роботі з невеликими обсягами доцільно вести в періодичному режимі в кілька етапів.

-стерилізація всіх комунікацій і ферментера гострим або глухим паром;

-наповнення апарату прогрітій гомогенизированной середовищем;

-нагрівання живильного середовища до температури стерилізації;

-витримування при температурі стерилізації протягом часу, необхідного для загибелі всіх мікроорганізмів;

-охолодження стерильною живильного середовища в цій же ємності.

Цей спосіб стерилізації тривалий, і тому щоб уникнути істотних змін у складі середовища, процес ведуть при надмірному тиску 0,5-1 атм при температурі 110-120° С протягом 1-1,5 годин з моменту досягнення заданої температури.

Особливу увагу слід приділяти стерилізації апаратури і комунікацій, призначених для подачі пеногасителя (125-135° С протягом 1,5-2 годин). Стерилізацію здійснюють у такій послідовності:

-вхідний і вихідний фільтри тонкого очищення, трубопроводи, арматура;

-ферментери;

-живильне середовище при наступних режимах: температура - 120-124° С, час витримки після досягнення заданої температури - 40-60 хв.

Підготовку ферментаторів (інокуляторов) до роботи починають з промивання використаного устаткування гарячою і холодною водою з наступною обробкою апаратів і комунікацій гарячим паром. Стерилізацію поживних середовищ здійснюють традиційним способом, так само як і підготовку технологічного повітря. Розчинні компоненти середовища нагрівають до певної температури, потім витримують при цій температурі з подальшим охолодженням до температури ферментації.

Підготовка повітря

На першому етапі відбувається очищення атмосферного повітря від пилу та його стиснення.

Атмосферне повітря надходить через фільтр попереднього очищення 1 в компресор 2, де стискається до необхідного тиску (350-500кПа).

На другому етапі стиснене повітря необхідно підтримувати в оптимальному термодинамічному стані. При стисненні повітря нагрівається до 100-200 градусів, тому його охолоджують у теплообміннику до 25-30 градусів. При охолодженні стисненого повітря конденсується наявна в атмосферному повітрі волога, яку відокремлюють у осушувач. Після відділення води повітря нагрівають до температури культивування мікроорганізмів в теплообміннику - нагрівачі. Далі повітря надходить у головний фільтр, де підтримується його оптимальна температура і вологість. У фільтрі відбувається холодна стерилізація повітря, так як разом з частинками пилу відділяються і клітини мікроорганізмів.

На третьому етапі здійснюється остаточна стерилізація повітря в індивідуальному фільтрі тонкої очистки.

Очищення продукту

Залежно від того, де антибіотичну речовину зосереджено, застосовують відповідні методи його витягання. Так, якщо антибіотик знаходиться в культуральній рідині, його виділяють методами екстракції, використовуючи для цього розчинники, смешивающиеся з рідкою фазою, осаджують у вигляді нерозчинного з'єднання або сорбували іонообмінними смолами. З клітин мікроорганізмів антибіотик виділяють за допомогою екстракції органічними розчинниками. Якщо антибіотик міститься і в культуральній рідині, і в клітинах продуцента, то спочатку антибіотик переводять у фазу, з якої найбільш доцільно його ізолювати. Наприклад, антибіотик, що міститься в культуральній рідині, і клітини з антибіотичним речовиною переводять в осад, з якого антибіотик екстрагують.

Відділення нативного розчину від біомаси і зважених часток проводять методами фільтрації або центрифугування. Для фільтрації застосовують фільтр- прес, нутч - фільтр, друк- фільтр, центрифуги, сепаратори. Фільтр- преси вживають для обробки великих обсягів культуральної рідини. Апарати складаються з ряду чергуються плит і рам і фільтруючих перегородок між ними. Процес фільтрації здійснюється під тиском.

Для фільтрації невеликих обсягів культуральної рідини зазвичай використовують нутч - фільтри або друк- фільтри. Перший апарат працює під вакуумом , а в другому процес фільтрації здійснюється завдяки підтримці тиску над фильтрующейся рідиною.

Широко поширений і спосіб центрифугування. Хороші результати отримують в тому випадку, якщо при правильному виборі швидкості подачі рідини швидкість обертання центрифуги досягає 15 ТОВ об / хв . Відокремлювати міцелій або інші зважені частинки можна також в сепараторах. При швидкості обертання барабана сепаратора 7000-7500 об / хв завдяки відцентровій силі тверді частинки спрямовуються до стінок барабана і осідають там, а отсепарирован рідина прагне центру барабана і піднімається вгору в спеціальну камеру.

Мета хімічного очищення - витяг антибіотика з на - тивной рідини або з клітин продуцента, його концентрація і звільнення (власне очищення) від супутніх домішок і в кінцевому рахунку отримання високоочищеного препарату, придатного для відповідного застосування.

У ряді випадків антибіотичні речовини під впливом жорстких зовнішніх факторів (підвищена температура, висока кислотність або лужність та ін) втрачають свої властивості, інак - тівіруются. Тому при їх виділенні і очищенні необхідно дотримуватися максимум обережності. Наприклад, поліеновие макролідние антибіотики містять ряд чутливих до зовнішніх впливів угруповань: сполучені подвійні зв'язки, аминосахара, макролактонного кільце. Все це робить їх нестабільними при виділенні і очищенні.

Нестабільність названих груп антибіотиків зумовлена, як правило, їх термоокислительной інактивацією. Причому початкова стадія інактивації пов'язана з утворенням вільних радикалів, пероксидів і деяких інших з'єднань на стадії виділення й очищення.

Застосування антиоксидантів сприяє стабілізований полієнів при екстракції їх з міцелію.

Основні методи очищення антибіотиків наступні.

Метод екстракції. Нерідко для очищення антибіотика від різних домішок його багато разів переводять з одного розчинника в інший з попередніми осадженням (кристалізацією). Такий прийом носить назву перекристалізації.

Іонообмінна сорбція. Водні розчини антибіотиків, які є по хімічній природі кислотами, основами або амфотернимі сполуками, пропускають через колонки з відповідними іонообмінними смолами, на яких антибіотики сорбуються, а розчин з частиною домішок, мають протилежний антибіотика заряд, проходить через колонку. Смоли залежно від позитивного чи негативного заряду їх іонів називають катионитами або аніонітами. Антибіотик (як негативно заряджений іон) буде сорбироваться на катіонітної смолі, і навпаки. Адсорбований на смолі антибіотик елюіруют (десорбується), в результаті чого отримують значно очищений і концентрований препарат. Потім розчин цього препарату можна знову пропустити через іонообмінну смолу, але має протилежний заряд. При цьому на смолі осядуть домішки, а розчин більш очищеного антибіотика пройде через колонку.

Метод осадження. Антибіотик пов'язують з органічними або неорганічними речовинами для одержання сполуки, що випадає в осад, останній за допомогою фільтрів або центрифугування відділяють від нативного розчину, промивають і в ряді випадків висушують. Утворене з'єднання розчиняють і антибіотик екстрагують або знову осаджують (кристалізують).

Одна зі стадій хімічного очищення антибіотиків - концентрування отриманих розчинів; досягається це відгонкою більшої частини розчинника, як правило, у високому вакуумі.

Застосовувані методи виділення і хімічного очищення, а також якість обладнання і використовуваних реактивів мають велике значення насамперед для поліпшення якості отримуваного антибіотика і збільшення виходу препарату.

---

⇐ Предыдущая45678910Следующая ⇒

---

Просмотров 3442

Эта страница нарушает авторские права

---