Опишите рост клеток в монослое

В клеточной культуре понятие монослоя обычно относят к слою клеток, в которых нет клеток, растущих поверх других, а все из них растут вплотную друг к другу и часто соприкасаются друг с другом на одной и той же поверхности роста.

Культуральная посуда. Монослойное культивирование осуществляют во флаконах (флаконы Ру – самые большие стационарные флаконы поверхностью до 200 см2) или пробирках для культуры тканей, обеспе чивающих поверхность роста 5−200 см2.

В случае монослойных культур необходимо проводить систематические пассажи клеток, используя для этого культуры предыдущего рассева или музейные клетки, сохранившиеся в условиях консервации. Полноценная популяция может быть получена только от генерации, состоящей из жизнеспособных клеток.

При отсутствии каких-либо ограничений клетки равномерно распределены по клеточному циклу, и если количество клеток удваивается через правильные промежутки времени, то культура находится на стадии экспоненциального роста (2). Обычно после короткого периода экспоненциального роста тот или иной фактор становится лимитирующим. Это может происходить в результате истощения какого-либо фактора среды или же в результате того, что культивируемые клетки полностью покроют поверхность, на которой они растут. Скорость роста при этом замедляется, и количество клеток в культуре достигает насыщения (конечная плотность клеток). Когда дальнейшие деления клеток прекращаются, наступает стационарная фаза роста культуры (3).
При восстановлении в культуре лимитирующего фактора клетки возвращаются в фазу G1 клеточного цикла, происходит синтез ДНК, после чего клетка делится. Есть несколько теорий, объясняющих такой тип контроля роста, но все они исходят из предположения, что контроль осуществляется на каком-то этапе, расположенном вскоре после деления. После прохождения этого этапа клетки включаются в клеточный цикл и делятся. Большая часть клеток у животных находится под такой формой контроля роста, что они прекращают продвижение по клеточному циклу, вскоре после митоза. Следовательно, для стимуляции первичной культуры, прежде чем клетки возобновят движение по циклу к фазе деления, следует устранить ограничение роста. Клетки некоторых быстрорастущих опухолей утрачивают чувствительность к контролю роста, и поэтому полученные из опухолей первичные клетки легко адаптируются к росту в культуре и могут расти до более высокой плотности по сравнению с клетками из нормальных тканей.
По мере роста клеточного монослоя происходят следующие изменения: клетки становятся более скученными и менее распластанными, что приводит к уменьшению доли клеточной поверхности, обращённой к среде; среда истощается по питательным и другим компонентам, особенно в зоне, непосредственно примыкающей к клеткам.
Если из плотного монослоя нетрансформированных клеток удалить часть пласта, то в клетках, примыкающих к краю такой "раны", происходит стимуляция синтеза ДНК и делений. В результате клетки быстро занимают поверхность "раны" в монослое.
Первичные клетки, которые делятся в культуре, могут претерпевать так называемое контактное торможение движения. Когда две клетки приближаются друг к другу, то в зоне контакта прекращаются специфические движения клеточной мембраны. Первичные клетки, следовательно, не могут расти друг над другом, и в большинстве случаев достижение полного монослоя сопровождается прекращением клеточных делений. Этот феномен характерен не только для первичных клеток, но наблюдается также во многих клеточных линиях. Нетрансформированные клетки могут в течение некоторого времени сохранять жизнеспособность в таком покоящемся состоянии, но если их не пересеять, они погибают. Из сыворотки было выделено несколько факторов, обладающих способностью снимать контактное торможение.
Снижение распластывания клеток при достижении полного монослоя, а также ошаривание и прекращение роста клеток при их откреплении от подложки легли в основу представлений о тесной связи распластывания нетрансформированных клеток по мере их роста. Ослабленным контактным торможением характеризуются клетки, трансформированные вирусами, и такие клетки могут достигать более высокой конечной плотности. Считается, что эти клетки утрачивают зависящую от плотности регуляцию. Трансформированные клетки способны расти вплоть до полного истощения среды, и если после этого не наступает смена среды, то клетки быстро погибают.
Одним из факторов, лимитирующим рост клеток, является истощение в среде необходимых питательных компонентов. Следовательно, для получения высокой плотности клеток необходима периодическая замена питательной среды, а это может приводить к постоянному изменению состава среды, омывающей клетки, что весьма нежелательно.
Процесс подготовки клеточного монослоя к отделению от стекла и формированию суспензии (обработка клеток в монослое 0,02 % раствором химопсина в фосфатно-солевом буфере или 0,1 % трипсином и 0,01 % ЭДТА) происходит при комнатной температуре в течение 5−10 мин в зависимости от типа культуры и ее индивидуального состояния. Как только клеточный монослой достаточно разрыхляется и начинает отделяться от стекла, раствор фермента сливают, а в культуральную посуду заливают определенное количество ростовой среды. Этой средой тщательно смывают клетки со стенки сосуда и легким пипетированием способствуют образованию гомогенной взвеси. Полученную взвесь после подсчета числа клеток разводят ростовой средой до посевной дозы и используют при новых пересевах.
Монослойные культуры имеют ряд преимуществ, являющихся предпосылками их широкого использования:1) выделение секретируемого продукта многими клетками осуществляется эффективнее в случае их прикрепления к субстрату;
2) возможность быстрой и легкой замены питательной среды, сопоставления времени и количества среды с периодом роста клеток или временем наработки продукта;
3) обеспечение наибольшей гибкости исследований, поскольку в монослой могут быть введены любые типы клеток;
4) достижение искусственно высокой плотности клеток с использованием перфузионной техники;
5) возможность использования одной и той же аппаратуры с разным отношением клетки-среда, легко изменяемым в ходе эксперимента.
Однако при использовании монослойных культут выявляются и недостатки:
1) сложность масштабирования;
2) отсутствие информативности визуального анализа;
3) трудности с определением и поддержанием таких параметров, как кислотность и содержание О2, и обеспечением гомогенности культуры клеток;
4) необходимость значительных пространств.