Иммобилизация мицелия гриба в колбах на круговой качалке

Для проведения экспериментов по иммобилизации были выбраны субстраты, которые по литературным данным являются лучшими носителями:

ü губки из нержавеющей стали [Rodríguez Couto S. et al., 2004],

ü растительная губка люфа [Iqbal M. et al., 2005].

Кроме того, для испытаний в качестве носителя для иммобилизации мицелия были выбраны следующие лигноцеллюлозные материалы:

ü дубовые опилки, как показавшие наибольшую способность интенсифицировать синтез лакказы;

ü сосновые стружки, как доступный отход деревоперерабатывающей промышленности;

ü костра льна, как доступный отход льноперерабатывающей промышленности.

Губки из нержавеющей стали были порезаны на кусочки диаметром приблизительно 1,5 см. Перед использованием носитель был подвержен кипячению в течение 10 мин, а затем трижды промыт дистиллированной водой.

Люфа была порезана на диски диаметром 2,5 см и толщиной 2-3 мм. Перед использованием носитель был подвержен кипячению в течение 30 мин, а затем трижды промыт водой.

Остальные носители (дубовые опилки, сосновые стружки, костра льна) использовали в исходном виде, без дополнительной обработки.

Все выбранные носители были подвержены стерилизации в автоклаве при температуре 121 ºС в течение 20 мин.

Поскольку целью исследования было получение исходных данных и разработка экспериментальной установки для биодеградации ксенобиотиков, одной из важнейших характеристик которой является объем, носители испытывали в эквивалентных по объему, а не по площади поверхности количествах.

Для проведения иммобилизации была использована методика, предложенная

Iqbal c соавторами [Iqbal M. et al., 2005 ].

Иммобилизацию продуцента осуществляли в колбах Эрленмейера объемом 750мл на круговой качалке. В боксе в стерильных условиях в зоне пламени горелки в колбы вносили 150 мл питательной среды, 0,5% по объему посевного материала (II пассаж, 3 суток роста) и носители в количестве 50 см³, что составляло для дубовых опилок – 2 г, костры льна – 2 г, стальных губок – 6 г, люфы – 3 г, сосновые стружек – 3 г (удельная площадь поверхности составила 96,8 см²/г ). В контрольные колбы вносили 150 мл питательной среды и 0,5% по объему посевного материала (II пассаж, 3 суток роста). Активность посевного материала составила 6,2 Е_ОА.

Питательная среда имела следующий состав: мука пшеничная – 29,0 г/л; кукурузный экстракт – 6,4 г/л; NH₄NO₃ – 2,0 г/л; КН₂РО₄ – 1,3 г/л; вода водопроводная – до 1 л. Для стимулирования продуцирования лакказы в среду был добавлен CuSO₄ в концентрации 0,05г/л. pH среды до стерилизации – 5,6-5,8.

Затем колбы инкубировали на круговой качалке с частотой вращения 200 об/мин при температуре 32 ºС в течение 10 суток. Опыт осуществляли в трех повторностях.

Эффективность иммобилизации оценивали по отсутствию биомассы гриба в культуральной жидкости.

В результате проведения экспериментов по иммобилизации было установлено, что наилучшим образом иммобилизация мицелия гриба Trametes hirsuta 56 качалочным способом происходит на стальных губках и растительной губке люфа рисунок 2.

Стальных губки и растительная губка люфа устойчивы к механическим и химическим воздействиям, изменениям температуры и pH среды, но определяющим, по-видимому, является то, что их структура обеспечивает свободный доступ водной среды к иммобилизованным клеткам гриба.

Использование дубовых опилок и костры льна в качестве носителей при иммобилизации мицелия гриба качалочным способом оказалось неэффективным, о чем свидетельствовало наличие биомассы гриба в культуральной жидкости рисунок 3, что, по-видимому, связано с отсутствием объемной структуры у этих субстратов.

а) б)

Рисунок 3. Иммобилизация биомассы гриба на: а) дубовых опилках, б) костре льна

В колбах с сосновыми стружками образовался плотный комок из стружек и иммобилизованного мицелия грибной культуры. В культуральной жидкости биомассы гриба не наблюдалось, что свидетельствует о том, что сосновые стружки являются хорошим носителем для иммобилизации, но способ иммобилизации на качалке для них не подходит рисунок 4.

Рисунок 4. Иммобилизация биомассы гриба на сосновых стружках