Геномный импринтинг и аномалии оплодотворения

Наиболее яркое выражение импринтинга у млекопитающих — это функциональная некомплементарность мужских и женских геномов. В начале 80-х годов в лаборатории английского эмбриогенетика М. Сурани (М. Surani) из Кэмбриджа в опытах на мышах разработал микротехнику, позволяющую производить удаление и трансплантацию пронуклеусов на уровне оплодотворенной яйцеклетки. После удаления мужского или женского пронуклеуса восстанавливали диплоидность путем подавления первого деления дробления цитохалазином (см. обзоры: Баранов, 1988; Solter, 1988). Развитие таких гиногенот и андрогенот останавливалось на самых ранних стадиях. Если гаплоидному андрогенетическому зародышу трансплантировать другой мужской пронуклеус, развитие шло только до стадии нейрулы.

Поразительные по красоте и убедительности опыты были произведены в той же лаборатории с искусственным получением триплоидов в оплодотворенной яйцеклетке, и затем с избирательным удалением либо женского, либо мужского дополнительного ядра. У готовой к оплодотворению яйцеклетки млекопитающих мейоз блокирован на одной из конечных стадий (у человека, к примеру, на стадии метафазы II), и образование второго полярного тельца (конечная стадия мейоза) происходит после начала проникновения спермия в ооплазму. При искусственном подавлении второго полярного тельца в момент оплодотворения получали триплоидные зиготы с тремя пронуклеусами, из которых два женских и один мужской. Затем диплоидный набор восстанавливали, удаляя либо один из женских, либо мужской пронуклеус. В первом случае развитие шло нормально, тогда как во втором случае (вариант гиногенеза) зародыш мог достигать периода органогенеза, но затем неминуемо погибал.

Эти и другие сходные опыты убедительно показали, что у млекопитающих нормальное развитие возможно только при сочетании мужского и женского геномов, и что эти геномы, имея один и тот же набор генов, эпигенетически различны. Существенно прикладное значение этих данных для понимания ряда аномалий в репродукции человека. Следует иметь в виду, что: а) триплоидия — самая частая геномная аномалия у человека; б) у человека при оплодотворении регулярно, с определенной частотой происходит естественный андрогенез; в) в основе злокачественного перерождения клеток трофобласта (хорионэпителиомы), лежат явления, связанные с эпигенетической наследственностью, геномным импринтингом.

Феномен импринтинга приводит к тому, что в клетках трофобласта преимущественно активен мужской геном. Поэтому партеногенетическое развитие останавливается прежде всего ввиду невозможности развития трофобласта. Выдвинута интересная гипотеза, что у женских особей млекопитающих риск хорионэпителиомы уменьшается вследствие инактивации в их ооцитах генов, необходимых для роста и развития трофобласта (Varmuza, Mann., 1992). Импринтинг — это как бы механизм защиты самок от собственных яйцеклеток, у которых таким образом блокируется партеногенез.

Первое деление оплодотворенной зиготы является и первым делением созревания, так что особых сигналов к началу развития нет. Партеногенез и разные варианты оплодотворения и развития встречаются у большинства групп животных. Чемпионом, видимо, является палочник рода Bacillus, у которого, как обсуждалось в разделе 2.2.3 (рис. 1) в естественных условиях встречаются пять вариантов стратегии размножения: обычное половое, гибридогенез, партеногенез, гиногенез и андрогенез.

Относительно нормальным вариантом бесполого размножения у человека можно рассматривать образование из одной зиготы двух и более близнецов (монозиготные близнецы). На пути других вариантов размножения у млекопитающих в процессе эволюции возникли барьеры. Но они не абсолютны. В последние 15–20 лет выяснилось, что у человека достаточно регулярно происходит андрогенез в двух его вариантах — диспермия и диандрия. Однако это приводит к аномалиям репродукции и развития в силу хромосомного и геномного импринтинга.

Среди аномалий кариотипа, приводящих к спонтанным абортам, триплоидия после трисомии и моносомии занимает третье место (Назаренко, 1993). Триплоидия — наиболее частая геномная аномалия. С нею связаны 1,2% всех клинически распознаваемых беременностей и около 6% всех спонтаных абортов в первом триместре беременности (Lindor, et al., 1992). По данным исследования С. А. Назаренко (1993), в Томской области среди 200 спонтанных абортусов было найдено 12 случаев триплоидии (6%) и 5 диплоидно-тетраплоидных абортусов. Анализ происхождения дополнительного хромосомного набора у триплоидов оказался совершенно неожиданным и непредсказуемым. Примерно у 80% триплоидов дополнительный набор хромосом имеет отцовское происхождение.

Результат развития резко различен в зависимости от источника дополнительного набора хромосом. Эмбриогенез, хотя и аномальный, происходит только у тех триплоидных продуктов оплодотворения, у которых находятся два материнских набора и один отцовский. В случаях же диспермии, когда дополнительный набор хромосом пришел от отца, зародыш не развивается, а происходит кистозное разрастание ворсинок хориона (производных трофобласта), называемое пузырным заносом (hydatidiform mole или "гидатидиформный моль").

Цитогенетический анализ заносов принес новые неожиданности. Частота заносов довольно ощутима и в США составляет 1:500 родов, причем для женщин в возрасте старше 40 лет риск возрастает до 9% (Lindor, et al., 1992). Заносы по морфо-эмбриологическим критериям удалось разделить на две группы: частичные и полные. В первом случае гидрофобные разрастания захватывают лишь часть ворсинок. В случае же полных заносов не образуется низародыш, ни какие-либо эмбриональные ткани. Вместо них наблюдаются скопления наполненных жидкостью ворсинок хориона, напоминающие виноградные гроздья. Эти образования абортируются, однако отдельные клетки из них могут быть занесены кровотоком в другие ткани и органы и привести к злокачественному росту.

По данным С. А. Назаренко (1993), среди около 200 абортусовбыло найдено 4 случая полных и 8 частичных заносов, общая частота примерно 6%. Частичные заносы имеют обычно триплоидный кариотип с двумя разными отцовскими наборами (андрогенная триплоидия). Тогда как полные заносы имеют диплоидный набор хромосом, причем оба набора оказываются отцовскими по своему происхождению. То есть, налицо феномен регулярно происходящего естественного андрогенеза у человека! Здесь в полной мере проявляются феномен импринтинга и разные эпигенетические потенции мужского и женского геномов. Диплоидный андрогенез у человека, происходит двумя путями: 1) диспермия, когда зигота образуется при слиянии двух попавших в яйцеклетку спермиев — таковы около 25% всех полных заносов; 2) андрогения, в остальных 75% случаев, когда проникший в ядро мужской пронуклеус претерпевает дополнительное митотическое деление и затем оба митотических гаплоидных продукта сливаются, восстанавливая диплоидию, в итоге образуются так называемые "гомозиготные" заносы. Они имеют генотип либо 46,ХХ, либо 46,XY.

Ниже приведены обобщенные сведения о характере развития зиготы при разных вариантах оплодотворения. Эти данные ясно указывают на действие импринтинга и эпигенетическую некомплементарность женских и мужских геномов (Ben-Shetrit A., et al., 1995).

Анализ цитогенетики, а в будущем и молекулярной генетики, разных форм заноса в целях пренатальной диагностики очень важен. При полном заносе риск хорионэпителиомы чрезвычайно велик, при частичном заносе риск такой же, как в норме. Для установления дифференцированного диагноза и выбора правильной формы лечения С. А. Назаренко (1993) разработал схему комплексного обследования беременных женщин при подозрении на пузырный занос.

Открытие естественного андрогенеза у человека ставит перед медицинскими генетиками, специалистами в области репродукции человека и педиатрами ряд проблем, которые еще ждут своего решения на основе современных методов. Каков конкретный механизм нарушений развития при триплоидии и пузырных заносах? Какую роль играет изменение в соотношении Х-хромосом и аутосом и как происходит в этом случае процесс Х-хромосомной инактивации? Как проявляется хромосомный и генный импринтинг в случае частичных и полных заносов, какова роль генотипа в аномалиях воспроизведения?

Оплодотворение — это сложный многоступенчатый процесс, в который вовлечены гены, действующие уже на уровне гамет. Имеются косвенные данные о наличии наследственных факторов, которые передаются через отца функционируют в процессе оплодотворения в мужских гаметах и повышают вероятность диатермии и андрогении. На фенотипическом уровне это приводит к специфической аномалии воспроизведения, когда в некоторых родословных наблюдается прямое отцовское влияние на склонность к рождению близнецов с одновременным частичным бесплодием. В этих же родословных ожидается появление третьего типа близнецов: не моно- или дизиготных, а полуторазиготных; в то же время среди сибсов близнецов возможны первичные химеры (Голубовский, Голубовская, 1984; Голубовский, 1984, 1986).

Импринтинг хромосом и генов

Патогенез некоторых наследственных аномалий связан с импринтингом определенных хромосом и генов (Сапиенца К., 1990). Наиболее изученным примером заболеваний, этиологически связанных с импринтингом, являются синдромы Прадера-Вилли и Ангельмана. Оба синдрома обусловлены изменениями дозы и противоположным импринтингом одного и то же района длинного плеча хромосомы 15. Делеция этого сегмента в материнской хромосоме, как и отцовская дисомия по хромосоме 15 (то есть когда обе хромосомы 15 у пациента от отца) приводят к синдрому Ангельмана (резкие судорожные движения, умственная отсталость, неадекватная смешливость). Напротив, дисомия материнской хромосомы 15 и делеция отцовской копии сегмента приводят к синдрому Прадера-Вилли (умственная отсталость, ожирение, низкий рост и непропорционально малый размер рук и ног). Эти два сопряженных в цитогенетическом смысле заболевания могут быть связаны с реципрокными различиями в импринтинге двух соседних генов, расположенных в районе сегмента 15q11-13. Один из генов, причастных к развитию синдрома Прадера-Вилли, был клонирован у человека и у мышей. Он кодирует один из полипептидов ядерного рибонуклеопротеина, вовлеченного в передачу сигнала между нейоронами. Ген имеет длину в 25 т. н. п., включает 10 экзонов. Он активно экспрессируется на хромосоме отцовского происхождения, но метилирован на материнской хромосоме (Пузырев, Степанов, 1997).

Использование трансгенных модельных животных, главным образом, мышей, где изучаемый ген, сцепленный с известным геном-репортером (его присутствие определяется по специфической окраске) и поставленный под контроль индуцируемого промотора (например, с помощью теплового шока), искусственно вводится в геном определенной линии, дало новые большие возможности для изучения импринтинга. На мышах установлен противоположный импринтинг двух соседних генов Igf2 и Н19 (Peterson, Sapienza, 1993: Ben-Shetrit, et al., 1995). Изменение характера активности гена Igf2 (инсулино-подобный ростовой фактор) драматически влияло на ход самых ранних этапов развития. В начальных стадиях развития материнский ген выключен и активен лишь отцовский ген. У мышей был получен дефектный аллельный вариант гена Igf, и показано, что если в гетерозиготу эта мутация привнесена со стороны отца, рождаются мыши-карлики с 40% редукцией веса тела. Тот же самый ростовой дефект наблюдается у мутантных гомозигот.

Аналогичный ген у человека, обозначаемый как IGF-I1, экспрессируется лишь в отцовской хромосоме. Продукт этого гена связан с пролиферацией клеток плаценты. Ген высокоактивен в тканях трофобласта из пузырного заноса. Критическую роль в период имплантации яйцеклетки у человека играет активность другого гена H19. Он тесно сцеплен с геном IGF-II (район 11р15.5), но импринтируется противоположным образом — активен материнский аллель.

Получены данные об участии импринтинга в возникновении определенных видов детских раковых заболеваний — эмбриональной рабдосаркомы, опухоли Вильмса (рак почек) и остеосаркомы. В этих случаев первичным механизмом в патогенезе является инактивация рецессивного антионкогена именно в отцовской хромосоме (Сапиенца, 1990). Импринтинг причастен и к хорее Гентингтона. Это неизлечимое нейродегенеративное заболевание, наследуемое доминантно, обычно поражает людей старше 40 лет. Однако, примерно в 10% случаев болезнь развивается еще в детском возрасте. При этом 9 из 10 больных детей получают мутантный ген от отца.

В процессах импринтинга предложено разделять гены импринтируемые и импринтирующие, то есть те, которые подвергаются импринтингу и те, которые контролируют импринтинг (Peterson, Sapienza, 1993). К последним относятся гены, продукт которых представляет собой ДНК-связывающие белки. Они присоединяются к рецепторным участкам импринтируемых генов и влияют на степень их метилирования или степень компактизации данного сегмента хромосом. Несомненна связь феномена импринтинга с известным в генетике эффектом положения генов.

7.4. Новый тип нестабильных мутаций

В рамках мобильной генетики установлены разные случаи направленных изменений генов. Хорошо известны регулярно происходящие в ходе онтогенеза перемещения иммуноглобулиновых генов при развитии В-лимфоцитов — продуцентов антител. Механизм такого рода перемещений состоит в локальных рекомбинациях по сигнальным повторенным последовательностям (Хесин Р. Б., 1984).

Вообoе, можно считать за правило, что в пределах участков с повторенными блоками ДНК наблюдаются аномалии основных матричных процессов — транскрипции, репликации или трансляции, а также аномалии основных генетических процессов — рекомбинации, репарации и сегрегации (Прокофьева-Бельговская А. А., 1986; Хесин Р. Б., 1984). В отношении поведения подобных районов хромосом можно говорить об автогенезе на уровне ДНК (см. обсуждение в разделах 5.1 и 5.6). Хорошо изученны, например, упорядоченные изменения, связанные с повторами при селекции клеток в условиях повышенных доз цитостатиков. В этом случае можно предсказать последовательность событий. Участок хромосомы, где расположен ген устойчивости многократно умножается, амплифицируется, затем блоки тандемно повторенных генов могут отделиться от хромосомы и оказаться в цитоплазме как кольцевые плазмиды или линейные микрохромосомы (см. раздел 4.4.1).

Помимо Alu элементов геном человека насыщен микросателлитными последовательностями, состоящими из тандемных ди-, три- и тетрануклеоттидных повторов. Число их в геноме достигает 30–40 тыс., они встречаются в среднем через каждые 1000–1500 нуклеотидов (Nadir, et al., 1996; Баранов, 1996). В последнее десятилетие обнаружено, что нестабильное поведение некоторых генов, приводящих к довольно распространенным наследственным заболеваниям, связано со скоплением в кодирующих районах соответствующих генов определенных тринуклеотидных повторов. Среди этих заболеваний — мышечная дистрофия Дюшена, болезнь Гентингтона, синдром ломкой Х-хромосомы. На примере последнего дефекта мы разберем некоторые интересные особенности этого типа нестабильности.