Главная Обратная связь
Дисциплины:
Архитектура (936)
Биология (6393)
География (744)
История (25)
Компьютеры (1497)
Кулинария (2184)
Культура (3938)
Литература (5778)
Математика (5918)
Медицина (9278)
Механика (2776)
Образование (13883)
Политика (26404)
Правоведение (321)
Психология (56518)
Религия (1833)
Социология (23400)
Спорт (2350)
Строительство (17942)
Технология (5741)
Транспорт (14634)
Физика (1043)
Философия (440)
Финансы (17336)
Химия (4931)
Экология (6055)
Экономика (9200)
Электроника (7621)
Учет результатов посева диагностического материала
|
|
При выделении культуры кислотоустойчивых микобактерий, отвечающих вышеперечисленным характеристикам, а именно:
— появление роста колоний на плотных питательных средах не ранее 3-4 недель инкубации;
— наличие колоний характерной морфологии и окраски;
— микроскопическое подтверждение кислотоустойчивости выделенного микроорганизма при окраске по Ziehl-Neelsen;
следует произвести количественную оценку интенсивности роста.
Интенсивность ростаобозначают по 3-х балльной системе:
(1+) — 1— 20 КОЕ — “скудное” бактериовыделение;
(2+) — 21— 100 КОЕ — “умеренное” бактериовыделение;
(3+) — > 100 КОЕ — “обильное” бактериовыделение.
Регистрируют число КОЕ, выросших на каждой из пробирок с разными питательными средами.
Величина КОЕ (число колониеобразующих единиц) высчитывается как среднее по результатам подсчета числа колоний, выросших на всех пробирках.
Все характеристики выросших на плотных питательных средах микобактерий заносятся в лабораторный журнал учета результатов культуральных исследований, в бланки ответов, а также в компьютерную базу данных полицевого учета.
V. ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ МИКОБАКТЕРИЙ КОМПЛЕКСА
MYCOBATERIUM TUBERCULOSIS
1.ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ КОМПЛЕКСА
MYCOBATERIUM tuberculosis
Первичная идентификация микобактерий комплекса M. tuberculosis от нетуберкулезных микобактерий осуществляется по следующим культуральным характеристикам:
¾ cскорость роста на плотных питательных средах;
¾ пигментообразование;
¾ морфология колоний;
¾ наличие кислотоустойчивости;
¾ температура роста.
Таблица 5
Культуральные признаки комплекса M. tuberculosis
| Культуральные признаки | Комплекс M. tuberculosis |
| Скорость роста | Медленнорастущие - > 3 недель |
| Пигментообразование | Цвет слоновой кости |
| Морфология колоний | R или S формы |
| Наличие кислотоустойчивости | Выраженная кислотоустойчивая окраска |
| Температура роста | Оптимальный рост при 35 — 370С |
Несмотря на то, что предварительное заключение о выделении микобактерий туберкулеза может быть сделано опытным бактериологом на основании вышеперечисленных характерных признаков,
| подтверждение принадлежности выделенной культуры микобактерий к комплексу M. tuberculosis на основании специальных лабораторных тестов является обязательным |
2. ОCНОВНЫЕ БИОХИМИЧЕСКИЕ ТЕСТЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ
M. tuberculosis
К сожалению, не существует какого-либо одного лабораторного метода, позволяющего с достоверностью отличить микобактерии комплекса M. tuberculosis от других кислотоустойчивых микобактерий. Тем не менее, сочетание вышеописанных признаков с результатами ряда приводимых ниже биохимических тестов позволяет провести идентификацию микобактерий комплекса M. tuberculosis с точностью до 95% (см. Таблицу 6).
Для дифференциации микобактерий комплекса M. tuberculosis, к которому относятся следующие виды микобактерий: M. tuberculosis, M. bovis., M. africanum, M. microti — от медленнорастущих нетуберкулезных кислотоустойчивых микобактерий необходимо применять следующие основные биохимические тесты:
¾ тест на наличие способности продуцировать никотиновую кислоту (ниациновый тест);
¾ тест на наличие нитратредуктазной активности;
¾ тест на наличие термостабильной каталазы;
¾ тест на способность наличие раоста на среде с натрием салициловокислым (1 мг/мл).
В качестве дополнительных можно использовать также следующие тесты:
¾ рост на среде, содержащей 500 мкг/мл пара-нитробензойной кислоты;
¾ рост на среде, содержащей 5% хлорида натрия.
Для дифференциации M. tuberculosis и M. bovis следует учитывать результаты следующих проб:
— ниациновый тест;
— тест на наличие нитратредуктазы
— тест на наличие пиразинамидазы;
— рост на среде, содержащей 2 мкг/мл гидразида тиофен-2 карбоксиловой кислоты (TCH).
Таблица 6
Тесты для дифференциации микобактерий комплекса M. tuberculosis
| Дифференциальные тесты | Микобактерии | |
| M. tuberculosis | Нетуберкулезные медленнорастущие | |
| Основные биохимические тесты на наличие: | ||
| Никотиновой кислоты | + | —* |
| Нитратредуктазы | + | ± |
| Термостабильной каталазы | — | + |
| Рост на среде с натрием салициловокислым (1000 мкг/мл) | — | +/± |
| Дополнительные тесты: рост на средах, содержащих: | ||
| Паранитробензойную кислоту (500 мкг/мл) | — | + ** |
| Натрия хлорид 5% | — | +*** |
*За исключением M. simae
**За исключением M. gastri
**За исключением M. marinum, M. terrae
Таблица 7
Тесты для дифференциации отдельных видов микобактерий
комплекса M. tuberculosis
| Дифференциальные тесты | Виды микобактерий комплекса M. tuberculosis | |||
| M. tuberculosis | M. bovis | M. africanum | M. microti | |
| Основные биохимические тесты на наличие: | ||||
| Никотиновой кислоты | + | — | +/ — | +/ — |
| Нитратредуктазы | + | — | — | — |
| Термостабильной Каталазы | — | — | — | —/+ |
| Рост на среде с натрием салициловокислым (1000 мкг/мл) | — | — | — | — |
| Дополнительные тесты: рост на средах, содержащих: | ||||
| Пиразинамид | + | — | + | + |
| Мочевина | +/— | +/— | + | +/— |
| Гидролиз твина в течение 10 дней | —/+ | —/+ | — | —/+ |
| ТСН (2 мкг/мл) | + | — | +/— | +/ — |
Ниациновый тест
Ниацин (производное никотиновой кислоты)играет чрезвычайно важную роль в осуществлении всех окислительно-восстановительных реакций, происходящих в клетках кислотоустойчивых микобактерий. Ниацин продуцируют все микобактерии, однако исследования показали, что у M. tuberculosis в результате блокирования ряда метаболических путей никотиновая кислота накапливается в больших количествах, во много раз превышающих ее содержание в клетках микобактерий других видов. Ниацинотрицательные штаммы M. tuberculosis встречаются чрезвычайно редко. В то же время ниациновый тест не должен использоваться как единственный для идентификации M. tuberculosis, так как отдельные штаммы M. bovis, в том числе и субштаммы BCG, а также некоторые виды нетуберкулезных микобактерий (M. simiae, M. chelonae chemovar niacinogenes) обладают относительно высокой способностью синтезировать ниацин и давать положительную реакцию. Это указывает на необходимость при дифференциации выделенных микобактерий не ограничиваться только ниациновой пробой, а по возможности использовать весь рекомендованный выше комплекс реакций.
Принцип метода.Ниациновая проба основана на том, что продуцируемая микобактериями никотиновая кислота, вступая в реакцию с цианистыми соединениями, дает ярко-желтое окрашивание. Наибольшее количество никотиновой кислоты обнаруживается у штаммов, выращенных на среде Левенштейна-Йенсена, поэтому именно эта среда используется для проведения ниациновой пробы. Подлежащая дифференциации культура микобактерий должна быть выращена на среде Левенштейна-Йенсена в течение не менее 3-4- недель и должна иметь достаточно массивный (не менее 50 колоний) рост.
| При отрицательном результате реакции следует повторить ее после 6 или более недель инкубации посева, так как возможно, что молодая культура микобактерий не выделила достаточное для реакции количество никотиновой кислоты |
При постановке ниациновой пробы необходимо иметь в виду, что M. tuberculosis выделяют продуцируемую ими никотиновую кислоту в питательную среду, на которой они выращиваются. В связи с этим при наличии на поверхности косяка с питательной средой сливного роста микобактерий возможен ложноотрицательный результат реакции, так как экстрагирующий ниацин реактив не всегда может проникнуть в глубь питательной среды. Для облегчения проникновения экстрагирующего реактива в питательную среду необходимо при наличии на ее поверхности сливного роста микобактерий либо снять и удалить часть колоний, либо проколоть поверхность культуры.
Реакция требует свободного доступа кислорода на протяжении всего исследования, поэтому следует пользоваться либо ватно-марлевыми пробками, либо специальными металлическими колпачками, обеспечивающими свободный доступ воздуха в пробирку.
Ниациновый тест можно выполнять либо с растворами химических реактивов, приготавливаемыми непосредственно перед постановкой пробы, либо с заранее приготовленными в лабораторных условиях или коммерческими бумажными полосками.
Ниациновый тест с растворами химических реактивов требует соблюдения максимальной осторожности, так как цианистые соединения чрезвычайно токсичныпри ингаляции паров и вызывают слезотечение, а анилин обладает онкогенным воздействием и способен проникать через кожный барьер. Пробу следует проводить только в вытяжном шкафу! Эти обстоятельства ограничивают применение ниациновой пробы с растворами химических реактивов.
В большинстве бактериологических лабораторий для постановки ниациновой пробы пользуются специально приготовленными бумажными полосками. Преимущество этого метода заключается в использовании вместо цианистых соединений роданистого калия — вещества более безопасного и доступного для бактериологических лабораторий, а также в быстроте реакции, позволяющей через 3-4 часа получить ответ о принадлежности выделенной на плотной питательной среде культуры к микобактериям человеческого вида или к другим микобактериям.
Следует иметь в виду, что из-за нестабильности растворов и реагентов необходимо строго соблюдать правила хранения и сроки использования как растворов и реагентов, так и бумажных полосок. В сомнительных случаях реагенты и полоски должны сравниваться со свежеприготовленными.
Реактивы для пропитывания бумажных полосок:
Раствор 1. 20% раствор ПАСК (парааминосалициловой кислоты)
В пробирку с 1,75 мл 960 этанола добавляют 0,25 мл диметилсульфоксида и 400 мг ПАСК.
Смесь подогревают на водяной бане при 560С в течение 5-10 минут при периодическом встряхивании до полного растворения ПАСК.
Раствор 2. 60% раствор роданистого калия
Навеску 1,5 г роданистого калия растворяют в пробирке с 2,5 мл 8% раствора лимонной кислоты
( 200 мг лимонной кислоты и 2,5 мл дистиллированной воды).
Раствор 3. 50% раствор хлорамина "Б"
3,125 г хлорамина "Б" растворяют в 6,25 мл дистиллированной воды на водяной бане при температуре 56 — 600С при периодическом встряхивании.
Индикаторные бумажные полоски размером 60х80 мм готовят из фильтровальной бумаги Filtrak 11 или аналогичной. Один конец полоски отмечают простым карандашом. Оттянутыми пастеровскими пипетками на полоски наносят по 1 капле свежеприготовленных растворов в следующем порядке:
- 20% раствор ПАСК — на отмеченный карандашом конец полоски;
- 60% раствор роданистого калия — на середину полоски;
- 50% горячий раствор хлорамина "Б" — на свободный конец полоски.
- Между каплями должны оставаться сухие промежутки.
Индикаторные полоски высушивают в темноте при комнатной температуре в течение 24 часов. Затем для получения более четких результатов наносят повторно 1 каплю хлорамина "Б" на уже высохшую каплю этого раствора. Полоски вновь высушивают, затем помещают в пробирки, закрывают резиновыми пробками и хранят в холодильнике. Полоски пригодны к употреблению в течение 3 месяцев.
Процедура исследования
¾ Добавить в пробирку с исследуемой культурой микобактерий 1 — 1,5 мл стерильной дистиллированной воды. При наличии сливного роста проткнуть поверхность среды в нескольких местах пипеткой для облегчения доступа раствора к питательной среде;
¾ поместить пробирку в термостат на 2 — 3 часа в полугоризонтальном положении с тем, чтобы жидкость покрывала всю поверхность среды;
¾ вынуть пробирку из термостата и перевести ее в вертикальное положение, позволив жидкости стечь на дно в течение 5 — 6 минут;
¾ в чистую стерильную пробирку перенести пипеткой 0,5 — 0,6 мл экстракта;
¾ индикаторную полоску помеченным карандашом концом, на который нанесена ПАСК, опустить с помощью пинцета в пробирку с экстрактом, не допуская смачивания экстрагирующей жидкостью средней части полоски, на которую был нанесен роданистый калий;
¾ немедленно закрыть пробирку резиновой пробкой;
¾ оставить при комнатной температуре на 15 — 30 минут; допустимо осторожно покачивать пробирку, пока вся полоска не пропитается экстрактом;
¾ наблюдать за окрашиванием жидкости на дне пробирки на белом фоне.
При положительном ниациновом тесте экстракт окрашивается в желтый цвет разной интенсивности. Любая окраска индикаторной полоски не принимается во внимание, так как это может происходить вследствие окисления реактивов в верхней части полоски. Для дегазации пробирок после проведения реакции пользуются 10% раствором нашатырного спирта, 10% раствором едкого натра или любым щелочным дезинфицирующим средством.
|
Просмотров 1491 |
|
|
