Стандарты интенсивности окраски, характеризующие активность нитратредуктазы

Чтобы обеспечить унификацию положительных результатов теста по выявлению способности микобактерий восстанавливать нитраты, рекомендуется использовать заранее приготовленную серию стандартов, соответствующих различной активности нитратредуктазы. Активность этой ферментной системы выражается в интенсивности окраски — от "+/-" до "5+" (См. выше). Эти стандарты можно хранить неопределенно долго и использовать при каждой постановке нитратредуктазного теста.

Реагенты

Растворы:

1. 0,067 М раствор фосфата натрия двузамещенного (9,47 г безводного Na₂HPO₄ на 1000 мл воды)

2. 0,067 М раствор фосфата калия однозамещенного (9,07 г КН₂PO₄ на 1000 мл воды)

3. 0,067 М раствор фосфата натрия трехзамещенного (25,47 г Na₃PO₄ •12 Н₂О на 1000 мл воды)

4. 1% спиртовой раствор фенолфталеина (1 г на 100 мл 95% этилового спирта)

5. 1% спиртовой раствор бромтимолового синего (1 г на 100 мл 95% этилового спирта)

6. 0,01% раствор бромтимолового синего: внести 1,0 мл 1% раствора бромтимолового синего в 100 мл дистиллированной воды.

Рабочий буферный раствор:

Смешать 35 мл раствора №1, 5 мл раствора №2 и 100 мл раствора №3.

7. К 10 мл рабочего буферного раствора добавить 0,1 мл раствора №4 и 0,2 мл раствора №6.

Процедура

¾ Поставить в штатив 8 чистых пробирок (пробирки №№ 1 - 8).

¾ Внести 2 мл рабочего буферного раствора в 7 пробирок (с №2 до №8)

¾ Внести 2 мл раствора №7 в пробирку №1. Это — цветовой стандарт, соответствующий реакции максимальной интенсивности ("5+").

¾ В пробирку №2 внести 2 мл раствора №7. Хорошо перемешать и перенести 2 мл в следующую пробирку (№3). Продолжить серию двукратных разведений вплоть до пробирки №8, из которой вылить 2 мл смеси.

¾ В результате будут получены следующие цветовые стандарты:

пробирка №1 = 5+

пробирка №2 = 4+

пробирка №3 = 3+

пробирка №5 = 2+

пробирка №6 = 1+

пробирка №8 = +/-

¾ ПроаАвтоклавировать пробирки, закрыть их герметично и хранить при 5°С.

Каталазный тест

Каталаза — это внутриклеточный растворимый фермент, который способен расщеплять перекись водорода на воду и кислород, т.е. обеспечивать следующую химическую реакцию: 2Н₂О₂ = 2Н₂О + О₂. При этом в реагирующей смеси образуются пузырьки кислорода, что указывает на наличие каталазной активности. Почти все виды микобактерий обладают каталазной активностью, за исключением M. bovis и некоторых резистентных к изониазиду штаммов M. tuberculosis.

В клетках микобактерий присутствует ряд изоферментов каталазы, отличающихся по термостабильности. Необходимо отметить, что нетуберкулезные микобактерии и некоторые сапрофиты синтезируют термостабильную каталазу.

При изучении каталазной активности микобактерий используют как качественные, так и количественные тесты:

· качественный (капельный) тест, указывающий на наличие каталазы (выполняется при комнатной температуре);

· полуколичественный тест, указывающий на уровень каталазной активности (измеряется высотой столбика пузырьков в пробирке);

· тест на термостабильность каталазы — тест определения наличия каталазы при 68°С и рН = 7,0.

Чувствительные к противотуберкулезным препаратам штаммы M. tuberculosis продуцируют каталазу, активность которой определяют капельным методом. При постановке полуколичественного теста столбик пузырьков газа не превышает 45 мм.

Для постановки этих тестов следует использовать двухнедельные культуры, дорощенные на среде Левенштейна-Йенсена при 35-37°С. Для выполнения указанных тестов пробирки с питательной средой помещают в свертыватель для коагуляции в вертикальном положении. При инкубации в стандартных условиях пробирки должны быть закрыты пробками, обеспечивающими газообмен и влажность. Продолжительность инкубации – 14 дней.

Реактивы

0,067 М фосфатный буферный раствор, pH = 7,0

Раствор 1

Раствор 2

Для получения 0,067 М фосфатного буфера смешать 611 мл раствора 1 и 389 мл раствора 2.

Раствор 3. Перекись водорода, 30%

30% раствор перекиси водорода (Н₂О₂) хранят в холодильнике.

· Проверить, чтобы при постановке теста был использован 30% раствор перекиси водорода, а не 3% раствор, который обычно получают из аптек.

· При работе с 30% раствором перекиси водорода используют резиновые перчатки и защитный щиток для глаз.

Раствор 4. 10% твин 80

Смешать твин 80 с дистиллированной водой и автоклавировать при 121°С в течение 10 минут. В процессе автоклавирования твин 80 может образовать осадок, который можно растворить при покачивании флакона сразу же после автоклавирования или в процессе охлаждения. Готовый раствор хранить в холодильнике.

Готовый каталазный реагент (смесь твина с перекисью водорода)

Непосредственно перед постановкой теста смешать равные объемы 10% раствора твина 80 и 30% раствора перекиси водорода. Для исследования каждого штамма требуется 1,0 мл каталазного реагента.

Контроли для тестов:

· Капельный метод

В качестве отрицательного контроля используют пробирку со средой Левенштейна-Йенсена без инокуляции культурой микобактерий, а в качестве положительного контроля – пробирку с референс-штаммом M. tuberculosis H37Rv, выращенным на среде Левенштейна-Йенсена.

· Полуколичественный метод и тест на термостабильность каталазы при 68°С

В качестве отрицательного контроля используют пробирку со средой Левенштейна-Йенсена без инокуляции культурой микобактерий, а в качестве положительного контроля — пробирку с референс-штаммом M. terrae, выращенным на среде Левенштейна-Йенсена.

Процедура исследования:

Капельный метод

Для постановки теста использовать двухнедельную культуру микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена, заранее убедившись в наличии роста микобактерий. В пробирку с ростом микобактерий добавить 1-2 капли свежеприготовленной смеси твина 80 с перекисью водорода (готовый каталазный реагент). Наблюдать в течение 5 минут, происходит ли образование пузырьков газа.

Результаты и их интерпретация:

Полуколичественный метод

Для постановки теста использовать двухнедельную культуру микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена, заранее убедившись в наличии роста микобактерий. В пробирку с ростом микобактерий добавить 1 мл свежеприготовленной смеси твина-80 с перекисью водорода, плотно закрыть пробирку и оставить на 5 минут при комнатной температуре. В пробирке образуется столбик пены.

Измерить высоту этого столбика от уровня жидкости в пробирке до верхнего края пены

Результаты и их интерпретация:

2.3.3. Тест на термостабильность каталазы при 68°С и рН = 7,0

Процедура исследования

С помощью стерильной пипетки внести с соблюдением правил асептики 0,5 мл 0,067 М фосфатного буферного раствора (рН = 7,0) в пробирку размерами 16х125 мм с завинчивающейся крышкой;

ê

С помощью стерильной бактериологической петли или лопатки суспендировать в этом растворе исследуемую культуру микобактерий (использовать несколько петель биомассы);

ê

Поставить пробирки с бактериальными суспензиями в предварительно нагретую водяную баню на 2 часа при температуре 68°С;