Процедура выполнения классического теста

Внести 0,2 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия
в пробирку с завинчивающейся крышкой;

ê

С помощью стерильной бактериологической петли или лопатки суспендировать в этом растворе четырехнедельную культуру микобактерий
(использовать две лопатки биомассы бактерий);

ê

Добавить 2 мл раствора 1 (раствор нитрата натрия в буфере);

ê

Хорошо встряхнуть и оставить на 3 часа в водяной бане при температуре 37°С;

ê

Добавить в следующем порядке:

1 каплю разведенной соляной кислоты (раствор 2),
хорошо встряхнуть пробирку;

2 капли 0,2% раствора сульфаниламида (раствор 3);

2 капли 0,1% раствора N-нафтилэтилендиамина (раствор 4);

ê

Немедленно проконтролировать появление розового или красного окрашивания, сравнив его интенсивность с цветовым стандартом.

Результаты и их интерпретация

Отрицательный результат — окрашивания нет. Если раствор остается бесцветным, это означает, что результат теста отрицательный или что процесс восстановления прошел слишком быстро, при этом нитриты восстановились до нитридов. Для того чтобы убедиться в истинности результата, необходимо Ддобавить в пробирку немного порошка цинка (небольшой объем порошка цинка перенесите из флакона на кончике слегка увлажненного аппликатора).

а) Если в растворе остался нитрат, цинк катализирует реакцию и появится красное окрашивание, что свидетельствует об истинно отрицательном результате теста.

б) Если после добавления порошка цинка красного окрашивания раствора не произошло, это означает, что результат теста положителен, но процесс восстановления прошел стадию нитрита.

Повторить тест, чтобы подтвердить его результат.

Положительным результат считают только в тех случаях, когда интенсивность окраски составляет от 3+ до 5+.

Модифицированный метод с использованием бумажных полосок

Для определения способности бактерий редуцировать нитраты можно использовать коммерческие бумажные полоски. При использовании данной модификации нитратредуктазного теста надежные результаты получаются в тех случаях, когда микобактерии интенсивно редуцируют нитраты (например, M. tuberculosis). Поэтому при идентификации микобактерий туберкулеза этот метод дает вполне приемлемые результаты и позволяет сократить трудозатраты, хотя стоимость бумажных полосок значительно выше.

Процедура выполнения теста

Внести 1 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия в пробирку
с завинчивающейся крышкой;

ê

С помощью бактериологической лопатки суспендировать
в этом изотоническом растворе четырехнедельную культуру микобактерий
в объеме 2-х лопаток;

ê

С помощью стерильного пинцета аккуратно внести в пробирку бумажную полоску для нитратредуктазного теста; при этом не допускается увлажнение полоски каплями жидкости на стенках пробирки;

ê

Тщательно закрыть крышку и оставить пробирку в вертикальном положении на 2 часа при температуре 37°С;

После первого часа инкубации осторожно встряхнуть пробирку,
не наклоняя ее и не переворачивая;

ê

После двух часов инкубации пробирку шестикратно наклонить, чтобы индикаторная полоска смочилась полностью;

ê

Оставить пробирку на 10 минут в наклонном положении, чтобы жидкость покрывала всю полоску;

ê

Появление красного окрашивания в верхней части полоски означает
положительный результат теста.

Результаты и их интерпретация

¾ Отрицательный результат — отсутствие окрашивания .

¾ Положительный результат — верхняя часть полоски приобретает красный цвет (оттенок от розового до темно-красного).

Предосторожности

¾ Перед проведением теста убедиться, что срок годности коммерческих тест-полосок не истек.

¾ Полоски чувствительны к солнечному свету, а также к повышенной температуре и влажности, поэтому их следует хранить в оригинальной упаковке в непрозрачном контейнере с крышкой при температуре 2—8°С.

¾ Не следует использовать обесцвеченные полоски. Если полоски обесцветились, они подлежат уничтожению, так как произошло снижение активности реагента.

¾ Результаты следует расценивать как сомнительные, если в положительном контроле получены слабоположительные или отрицательные результаты.