Антибиотики тетрациклинового ряда и их полусинтетические аналоги

Природные тетрациклины. К этой группе относятся полиоксиполикарбонильные соединения, основой химической структуры которых является частично гидрированный цикл тетрацена (нафтацена):

В медицине применяют тетрациклин и окситетрациклина дигидрат.

Тетрациклин был получен в 1953 году путём каталитического гидрирования хлортетрациклина, впервые выделенного из почв в 1948 г М. Дуггаром.

Окситетрациклин отличается от тетрациклина наличием гидроксила в положении 5, поэтому их общая формула имеет вид

Для получения природных антибиотиков тетрациклинового ряда используют микроорганизмы Streptomyces aureofaciens и Streptomyces rimosus.

По физическим свойствам природные тетрациклины — кристаллические вещества желтого или светло-желтого цвета, без запаха. Растворы в хлороводородной кислоте вращают плоскость поляризованного света влево, поэтому удельное вращение является одной из физических констант, подтверждающих подлинность (табл. 33.1).

33.1. Свойства природных тетрациклинов

Лекарственное вещество	Химическая структура	Описание
Tetracycline— тетрациклин	4-диметиламино-1,4,4а,5,5а,6,11,12а-октагидро-3,6,10,12,12а-пентаокси-6-метил-1,11-дикетонафтацен-2-карбоксамид	Желтый кристаллический порошок без запаха. Гигроскопичен. Удельное вращение от –265 до –275° в пересчете на сухое вещество (1%-ный раствор в 0,1 М растворе хлороводородной кислоты)
Oxytetracycline— окситетрациклин	4-диметиламино-1,4,4а,5,5а,6,11,12а-октагидро-3,5,6,10,12,12а-гексаокси-6-метил-1,11-дикетонафтацен-2-карбоксамида дигидрат	Светло-желтый кристаллический порошок без запаха. Удельное вращение от –188 до –200° (1%-ный раствор в 0,1 М растворе хлороводородной кислоты)

Тетрациклин и окситетрациклина дигидрат являются основаниями, поэтому тетрациклин очень мало растворим, а окситетрациклин практически нерастворим в воде; оба умеренно растворимы в этаноле. В воде и этаноле тетрациклин растворяется медленно. В хлороформе и эфире они практически нерастворимы или мало растворимы. Тетрациклин и окситетрациклина дигидрат легко растворимы в разведенных кислотах и щелочах, т.к. являются амфотерными соединениями. Обладают основными свойствами обусловленными наличием в молекуле диметиламиногруппы и поэтому вступают во взаимодействие с органическими и неорганическими кислотами (в частности, глюконовой, янтарной, яблочной, борной), образуя непрочные соли. Проявляют кислотные свойства за счет фенольных и енольных гидроксилов и дают соли с гидроксидами щелочных металлов. Образуют нерастворимые внутрикомплексные соединения (хелаты) с полизарядными катионами (кальция, магния, алюминия, железа, меди).

Указанные химические свойства лежат в основе испытаний доброкачественности тетрациклинов.

В качестве общих реактивов на тетрациклины используют соли меди (II), цинка, образующие окрашенные комплексы и разбавленную хлороводородную кислоту, в присутствии которой растворы тетрациклинов приобретают желтое окрашивание с зеленоватым (тетрациклин) оттенком или оранжево-красную окраску (окситетрациклин).

Подлинность тетрациклинов устанавливают с помощью цветных реакций. Реактивом, позволяющим отличать антибиотики друг от друга, является концентрированная серная кислота, под действием дегидратирующего воздействия которой образуются окрашенные ангидропроизводные:

В среде концентрированной серной кислоты ангидропроизводные тетрациклина окрашиваются в фиолетовый цвет, а окситетрациклина — в пурпурно-красный. При последующем добавлении к окрашенному раствору тетрациклина хлорида железа (III) фиолетовая окраска переходит в коричневую или красно-коричневую.

Окситетрациклина дигидрат под действием хлорида железа (III) в спиртовой среде приобретает коричневую окраску. Образование окрашенных продуктов обусловлено наличием фенольных гидроксилов в молекулах.

Способность тетрациклинов окисляться с образованием окрашенных продуктов позволяет использовать для их идентификации такие окислители, как хлорамин Б, селенистая кислота, нингидрин в различных растворителях. Указанные реактивы позволяют идентифицировать тетрациклины и отличать их друг от друга.

Известны также цветные реакции на антибиотики этой группы с нитропруссидом натрия, n-диметиламинобензальдегидом, реактивом Несслера. Наличие в молекулах фенольных гидроксилов обусловливает образование имеющих красное окрашивание азокрасителей при взаимодействии с различными диазосоединениями, которые присоединяются в положении 9:

Для качественного анализа антибиотиков тетрациклинового ряда используют также их способность образовывать в определенных условиях флуоресцирующие продукты. Так, при действии раствором гидроксида натрия происходит изомеризация с образованием изотетрациклина, имеющего голубую флуоресценцию в УФ-свете после нагревания в кипящей водяной бане.

Тетрациклин и окситетрациклин имеют в молекулах по две системы сопряженных связей и поэтому характеризуются наличием двух полос электронного поглощения. Для аналитических целей представляет интерес длинноволновая полоса, обусловленная присутствием в молекулах карбонильных групп. Удельный показатель поглощения (ФС) раствора тетрациклина при длине волны 380 нм должен быть равен 380-419 (раствор сравнения — 0,1 М хлороводородная кислота). Подлинность окситетрациклина подтверждают по величине оптической плотности (0,54-0,58) 0,002%-ного раствора в хлороводородной кислоте при длине волны 353 нм.

Подлинность тетрациклинов по ФС и МФ подтверждают, используя метод ТСХ. Тетрациклин растворяют в метаноле и хроматографируют относительно стандартных образцов на пластинках с закрепленным слоем силикагеля марки КСК 2,5 или пластинках «Сорбфил» в системе ацетон — вода (10:1,4). Для окситетрациклина используют систему этилацетат — ацетон — вода (20:19:1). После высушивания пластинку выдерживают в парах аммиака и просматривают в УФ-свете (366 нм). Зоны испытуемых и стандартных образцов должны быть идентичными.

При выполнении испытаний на чистоту по ФС в тетрациклине устанавливают спектрофотометрическим методом присутствие светопоглощающих примесей (при длине волны 430 нм). Величина оптической плотности должна быть не более 0,5. При аналогичном испытании 0,2%-ного раствора окситетрациклина оптическая плотность при 430 нм должна быть не более 0,25, а при 490 нм — не более 0,2. Методом ТСХ подобно испытанию подлинности обнаруживают присутствие специфических примесей (гидрохлоридов 4-эпитетрациклина, ангидротетрациклина, ангидро-4-эпитетрациклина). Указанные примеси ФС рекомендует устанавливать также методом ВЭЖХ. Методом ГЖХ определяют содержание остаточных растворителей (метанола, изооктанола).

Тетрациклин количественно определяют методом неводного титрования 0,1 М раствором хлорной кислоты. Титруют в смеси муравьиной, ледяной уксусной кислоты и диоксана (5:10:10). Эквивалентную точку устанавливают потенциометрически.

Сравнительные исследования показали сопоставимые результаты при количественном определении окситетрациклина биологическим (по ГФ XI) и дифференциальным спектрофотометрическим методами. В качестве растворителя использован 0,01 М раствор хлороводородной кислоты, аналитическая длина волны 353 нм. Разработана также методика дифференциального фотоколориметрического определения тетрациклина гидрохлорида с использованием в качестве реактива хлорамина Б в щелочной среде.

Биологическую активность тетрациклиновых антибиотиков определяют способом диффузии в агар с тест-культурой Bacillus subtilis (ГФ XI, вып. 2, с. 210). Один микрограмм химически чистого лекарственного вещества соответствует специфической активности равной одной единице действия. Следовательно, 1,0 г соответствует 1 000 000 ЕД.

Оценку биологической активности природных тетрациклинов можно также осуществить методом обратной турбидиметрии с тест-культурой Staphylococcus aureus 209 P. Степень мутности измеряют на фотоэлектроколориметре со светофильтром №7 (582 нм).

Применяют также способы фотоколориметрического определения, основанные на использовании цветных реакций с раствором хлорида железа (III), с диазосоединениями, хлорамином Б в щелочной среде и другими реактивами. Известны способы флуориметрического определения.

Лекарственные препараты тетрациклинов хранят по списку Б, в сухом, защищенном от света месте, при комнатной температуре. Упаковывают в стеклянные, хорошо укупоренные банки оранжевого стекла с навинчивающимися крышками, залитыми парафином (мастикой), или в другую подходящую тару.

При хранении тетрациклина и окситетрациклина наблюдается изменение окраски. На свету они темнеют. Это является следствием образования примеси 4-эпитетрациклина, ангидротетрациклина, 4-эпиангидротетрациклина и продуктов их дальнейшего превращения. Указанные вещества отличаются меньшей биологической активностью и более высокой токсичностью, чем исходные лекарственные вещества.

В растворах кислот и щелочей (с pH ниже 2), особенно при нагревании, тетрациклин и окситетрациклин легко разрушаются. Инактивация щелочных растворов обусловлена образованием изотетрациклиновых производных. Например, тетрациклин превращается в изотетрациклин:

Идентичные продукты образует окситетрациклин.

Тетрациклин и окситетрациклин — антибактериальные средства. Их механизм действия основан на подавлении биосинтеза белка микробной клетки. Применяют при пневмонии, бактериальной и амебной дизентерии, коклюше, гонорее, бруцеллезе, туляремии, сыпном и возвратном тифе и других инфекционных заболеваниях внутрь в виде таблеток, капсул, суспензий по 0,1–0,2–0,3 г 3–5 раз в день. Наружно назначают 1–3%-ные мази для лечения глазных заболеваний, ожогов, флегмон.

Полусинтетические тетрациклины. Одним из недостатков природных тетрациклинов является сравнительно высокая токсичность. В результате исследований, проведенных в нашей стране (во ВНИИА и ЛНИИА) и за рубежом, созданы полусинтетические аналоги природных тетрациклинов: доксициклин (вибрамицин), метациклин (рондомицин) и др.

Общая формула полусинтетических тетрациклинов:

R = –CH₃ или = CH₂

Производные 6-дезокситетрациклина получают из окситетрациклина, изменяя структуру молекулы в положении 6. Дезоксилирование приводит к образованию доксициклина (6-дезокси-5-окситетрациклина), а последующее превращение метильной группы в метиленовую дает возможность получить метациклин (6-дезокси-6-деметил-6-метилен-5-окситетрациклин):

Способы испытаний на подлинность, чистоту и количественная оценка синтетических и природных тетрациклинов во многом сходны.

Выпускают гидрохлориды доксициклина и метациклина, которые, как и природные тетрациклины, представляют собой желтые порошки (табл.33.2).

33.2. Свойства полусинтетических тетрациклинов

Лекарственное вещество	Химическая структура	Описание
Doxycycline Hydrochloride— доксициклина гидрохлорид (Вибрамицин)	4-диметиламино-1,4,4а,5,5а,6,11,12а-октагидро-3,5,10,12,12а-пентаокси-6-метил-1,11-диоксо-2-нафтаценкарбоксамида гидрохлорида гемиэтанолата гемигидрат	Желтый кристаллический порошок со слабым запахом этилового спирта
Methacycline Hydrochloride— метациклина гидрохлорид	4-диметиламино-1,4,4а,5,5а,6,11,12а-октагидро-3,5,10,12,12а-пентаокси-6-метилен-1,11-дикетонафтацен-2-карбоксамида гидрохлорид	Желтый порошок без запаха, горького вкуса

Доксициклина гидрохлорид легко, но медленно растворим в воде (1:3), легко растворим в метаноле (1:4) и мало — в этаноле. Метациклина гидрохлорид трудно и медленно (в течение 40 мин) растворим в воде (1:80) и в метаноле (1:40). В эфире и хлороформе оба практически нерастворимы.

Подлинность лекарственных веществ устанавливают по ИК-спектрам, сравнивая их со спектрами стандартных образцов. Методом УФ-спектрофотометрии подлинность подтверждают по удельному показателю поглощения, который у доксициклина гидрохлорида (280-310) устанавливают при длине волны 349 нм (растворитель — смесь 1 М раствора хлороводородной кислоты и метанола 1:99), а у метациклина гидрохлорида — при 345 нм. УФ-спектр раствора метациклина гидрохлорида в области 220-400 нм в том же растворителе имеет максимумы поглощения при 253 и 345 нм и минимумы при 223 и 299 нм. При длине волны 345 нм со стандартным раствором устанавливают относительную оптическую плотность метациклина, которая должна быть равна от 96 до 104%.

Доксициклин и метациклин дают цветные реакции с серной кислотой (желтое окрашивание) и хлоридом железа (III) — темное красно-коричневое окрашивание. Они дают также положительную реакцию на хлориды. Для установления подлинности и испытаний на наличие специфических примесей применяют метод ТСХ, аналогично испытаниям природных тетрациклинов.

Испытывают на наличие светопоглощающих примесей, измеряя оптическую плотность 1%-ных растворов полусинтетических тетрациклинов в смеси хлороводородной кислоты и метанола (1:99). Она должна быть не более 0,1. Методом ГЖХ в доксициклина гидрохлориде устанавливают наличие примеси этанола (4-6%), методом К. Фишера — воды (1,4-2,8%). В метациклина гидрохлориде меркуриметрическим методом количественно определяют содержание хлоридов (не менее 7,0% и не более 7,8%); в качестве индикатора используют раствор дифенилкарбазона.

Биологическую активность препаратов определяют методом диффузии в агар с тест культурой Bacillus subtilis.

Хранят лекарственные препараты полусинтетических тетрациклинов по списку Б, в сухом защищенном от света месте при комнатной температуре. Даже в темноте, особенно во влажной атмосфере и при повышении температуры, они постепенно разлагаются. Выпускают в капсулах — доксициклина гидрохлорид по 0,05, 0,1 и 0,2 г, метациклина гидрохлорид по 0,15 и 0,3 г. Показания для применения у полусинтетических тетрациклинов те же, что и у природных, но вследствие лучшей растворимости они быстрее всасываются, дольше сохраняются (до 24 ч) в крови, а также отличаются меньшей токсичностью.

ГЛАВА 34.