Окислительное фосфорилирование

В процессе окисления восстановленного НАД происходит освобождение энергии согласно следующего уравнения:

Эта энергия может быть использована в клетке для различных целей и, в том числе, для образования АТФ. Если учесть, что для процесса фосфорилирования АДФ требуется 7,3 ккал, то энергии, выделяемой в процессе окисления восстановленного НАД в дыхательной цепи, достаточно для синтеза нескольких молекул АТФ.

До настоящего времени механизм запасания энергии, выделяемой в процессе функционирования дыхательной цепи (окислительного фосфорилирования), окончательно не ясен. Существуют три основные гипотезы окислительного фосфорилирования: гипотеза химического сопряжения, конформационная теория окислительного фосфорилирования и гипотеза хемиоосмотического сопряжения.

Особое значение из этих гипотез имеет хемиоосмотическая гипотеза, предложенная в 1961 г. П. Митчелом. В 70-х годах прошлого столетия П. Митчел получил за нее Нобелевскую премию по биохимии.

В основу хемиоосмотической гипотезы легло наблюдение П. Митчела о том, что дыхание митохондрий (поглощение кислорода) сопровождается понижением рН среды, в которой они находятся.

Хемиоосмотическая гипотеза базируется на трех основных постулатах:

1. Окислительное фосфорилирование происходит в замкнутом пространстве, ограниченном внутренней митохондриальной мембраной.

2. Внутренняя митохондриальная мембрана непроницаема для протонов.

3. Во внутренней митохондриальной мембране существуют протонные насосы, которые обеспечивают через нее транспорт протонов.

В настоящее время установлено существование нескольких протонных насосов. В качестве одного из них выступает дыхательная цепь митохондрий. Энергия, которая выделяется в процессе транспорта электронов по дыхательной цепи, первоначально расходуется именно для выброса протонов из матрикса через внутреннюю митохондриальную мембрану в межмембранное пространство (рис. 72).

а б

Рисунок 72 – Протонные насосы внутренней митохондриальной

мембраны (а) и формирование за счет дыхательной цепи протонного градиента

на внутренней митохондриальной мембране (б)

Наибольшее количество протонов выбрасывается из митохондрий в результате переноса электронов через пункты фосфорилирования, локализованные в I, III и IV комплексах дыхательной цепи. Экспериментальные исследования показали, что при переносе двух электронов через III комплекс из митохондрий наружу выделяются шесть протонов. В то же время перенос двух электронов через II комплекс дыхательной цепи сопровождается выбросом из митохондрий только двух протонов.

В качестве другого протонного насоса митохондрий выступает фермент Н⁺-АТФаза (рис. 72, а). Этот энзим, встроенный во внутреннюю митохондриальную мембрану, катализирует реакцию гидролиза АТФ. Освобождающаяся в процессе данной реакции энергия расходуется для переноса протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану.

Выброс протонов из митохондрий приводит к неравномерному распределению протонов по обе стороны внутренней митохондриальной мембраны: их концентрация на наружной поверхности мембраны становится выше, чем в матриксе (рис. 72, б). Ввиду этого на внутренней митохондриальной мембране возникает протонный градиент, который формирует на ней электрохимический потенциал со знаком (+) снаружи и (–) внутри.

За счет работы дыхательной цепи и Н⁺-АТФазы внутренняя митохондриальная мембрана приобретает свойства своеобразного устройства, в котором происходит запасание энергии в виде электрохимического протонного потенциала (DmH⁺). Электрохимический протонный потенциал складывается из электрического и осмотического компонентов:

DmH⁺=DpH - DY,

где DpH – осмотический компонент, обусловленный неодинаковым содержанием протонов как частиц по разные стороны внутренней митохондриальной мембраны; DY – электрический компонент, обусловленный неодинаковым содержанием положительных зарядов протонов по разные стороны внутренней митохондриальной мембраны.

Электрохимический протонный потенциал представляет собой первичную форму запасания энергии в митохондриях. В дальнейшем эта энергия может использоваться для таких целей:

· синтеза АТФ (окислительного фосфорилирования);

· образования тепла у теплокровных животных (термогенез);

· механической работы;

· направленного переноса заряженных молекул через внутреннюю митохондриальную мембрану.

Особое значение при этом имеет синтез АТФ как универсального источника энергии в клетке.

Синтез АТФ в процессе окислительного фосфорилирования происходит при участии особого белкового фактора сопряжения митохондрий. За открытие этого фактора в 70-х годах прошлого столетия Э. Рэккер получил Нобелевскую премию по биохимии.

Фактор сопряжения представляет собой довольно крупную структуру, отчетливо видную на электронных фотографиях митохондрий. Он представляет собой грибовидную структуру, которая находится на внутренней поверхности внутренней митохондриальной мембраны.

Фактор сопряжения состоит из двух основных частей: мембранного компонента – протонного канала (F_о), пронизывающего насквозь внутреннюю митохондриальную мембрану, и каталитического немембранного компонента – АТФ-синтетазы (F₁), закрывающей с матриксной стороны просвет протонного канала (рис. 73).

Рисунок 73 – Строение фактора сопряжения

АТФ-синтетаза катализирует реакцию фосфорилирования АДФ с образованием АТФ. Характерно, что эта реакция идет спонтанно и не требует дополнительной энергии. Однако продукт реакции – АТФ оказывается прочно связанным с активным центром F₁. Диссоциация же возникающего комплекса энергозависима. Для ее обеспечения как раз и может использоваться энергия электрохимического протонного потенциала (рис. 74).

Рисунок 74 – Использование энергии протонного градиента для

освобождения синтезированного на F₁ АТФ

Накапливающиеся на наружной поверхности внутренней митохондриальной мембраны протоны по электрическому и осмотическому градиенту пытаются проникнуть в матрикс митохондрий. Однако внутренняя митохондриальная мембрана для них непроницаема. Поэтому их ток осуществляется через протонные каналы (F₀) фактора сопряжения. Проходя через эти каналы, протоны взаимодействуют с фактором F₁ (АТФ-син-тетазой), оказывая на нее своеобразное давление. В результате этого возникают конформационные сдвиги в белках каталитической части фактора сопряжения, что приводит к ослаблению их связи с АТФ. При этом синтезированная на F₁ молекула АТФ, освобождается в митохондриальный матрикс (рис. 74). Освободившаяся от АТФ АТФ-синтетаза вступает в новый каталитический цикл, связанный с фосфорилированием АДФ.

Изменение конформации фактора F₁, в результате которой становится возможной диссоциация его комплекса с АТФ, происходит только при достаточной величине протонного градиента на внутренней митохондриальной мембране. Понижение величины протонного градиента делает невозможным синтез АТФ, сопряженный с переносом электронов по дыхательной цепи и приводит к разобщению процессов дыхания и фосфорилирования. Вещества, вызывающие подобный эффект, называются разобщителями окислительного фосфорилирования.

Все разобщители окислительного фосфорилирования обладают способностью выступать в роли переносчиков протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану (протонофоров) и тем самым могут разрушать протонный градиент. Это связано с тем, что молекула разобщителя может обратимо протонироваться за счет внемитохондриальных протонов и в таком виде электрофоретически перемещаться к матриксной поверхности мембраны через ее гидрофобный слой. На внутренней поверхности внутренней митохондриальной мембраны происходит депротонирование разобщителя. Освободившийся при этом протон переходит в матрикс.

В том случае, когда во внутреннюю митохондриальную мембрану попадают разобщители, протоны, выброшенные из митохондрий, приобретают способность возвращаться в матрикс по градиенту концентрации не через протонный канал F₀, а непосредственно через любой участок мембраны. Подобный перенос предопределяет понижение величины протонного градиента. В результате этого, энергия протонного тока становится недостаточной для возникновения конформационных перестроек в белках каталитической части фактора сопряжения F₁.

Таким образом, разобщители, не оказывая существенного влияния на перенос электронов по дыхательной цепи, тормозят синтез АТФ в процессе окислительного фосфорилирования.

Классическим примером разобщителей является динитрофенол.

В качестве природных разобщителей выступают гормоны – адреналин и тироксин, жирные кислоты и др.

Окисление различных субстратов в митохондриях сопровождается неодинаковой продукцией АТФ в процессе окислительного фосфорилирования. Количественная оценка эффективности использования субстратов окисления для синтеза АТФ в процессе окислительного фосфорилирования определяется величиной Р/О. Этот показатель численно равен количеству синтезируемых молекул АТФ в расчете на один атом потребленного кислорода при окислении соответствующего субстрата.

Величина Р/О при окислении восстановленного НАД равна трем. Это связано с тем, что при переносе электронов от этого субстрата на кислород электроны проходят через три пункта фосфорилирования (рис. 75).

Р/О восстановленного ФАД соответствует двум, так как при окислении этого субстрата в дыхательной цепи электроны проходят только через два пункта фосфорилирования. В присутствии разобщителей величина Р/О для всех субстратов резко снижается.

Рисунок 75 – Расположение пунктов фосфорилирования

в дыхательной цепи митохондрий

Процесс окислительного фосфорилирования подвержен тонкой регуляции. Его интенсивность находится в прямой зависимости от энергети-ческих потребностей клетки, обеспеченности митохондрий субстратами окисления кислородом и др. В митохондриях осуществляется взаимная регуляция процессов дыхания и фосфорилирования АДФ. Она заключается в том, что интенсивность дыхания митохондрий прямо зависит от содержания в них субстрата фосфорилирования (АДФ). При повышении содержания АДФ интенсивность дыхания возрастает и наоборот, если концентрация АДФ снижается, что, как правило, сопутствует повышению содержания АТФ, интенсивность дыхания понижается. Зависимость интенсивности дыхания митохондрий от концентрации АДФ определяется термином “дыхательный контроль”.

Дыхательный контроль играет важную роль в процессе функционирования митохондрий. За счет него в условиях повышения интенсивности энергозависимых процессов, сопровождающихся понижением содержания АТФ и параллельным увеличением концентрации АДФ, возрастает интенсивность дыхания. Этот сдвиг приводит к увеличению скорости образования АТФ в процессе окислительного фосфорилирования и, таким образом, компенсирует потери АТФ. В состоянии покоя, когда в клетках довольно высок уровень АТФ и наоборот – низкое содержание АДФ, интенсивность дыхания снижается, что влечет за собой и понижение синтеза АТФ в процессе окислительного фосфорилирования.

Контрольные вопросы

1. Почему цикл трикарбоновых кислот играет центральную роль в метаболизме?

2. Обоснуйте положение о том, что цикл Кребса имеет отношение к анаболизму.

3. Почему при увеличении уровня энергетического обеспечения клетки происходит торможение скорости цикла трикарбоновых кислот?

4. Почему цикл Кребса играет центральную роль в энергетическом обеспечении клетки?

5. Чем объяснить известную последовательность функционирования переносчиков в дыхательной цепи митохондрий?

6. Почему по дыхательной цепи не переносятся протоны, а только электроны?

7. Почему отравление цианидами смертельно опасно?

8. Какой фермент цикла Кребса является компонентом дыхательной цепи митохондрий?

9. На уровне какого комплекса дыхательной цепи тормозится дыхание митохондрий при попадании в них барбитуратов?

10. Чем обусловлена цитотоксичность продуктов неполного восстановления кислорода в дыхательной цепи?

11. С чем связано проявление эффекта разобщителей? Каков механизм разобщающего действия?

12. Что представляет собой первичную форму хранения энергии в митохондриях?

13. Чему равна величина Р/О для окисления янтарной и яблочной кислот? От чего зависит величина Р/О?

14. Что представляет собой дыхательный контроль? В чем заключается его роль?

Глава 12. ФОТОСИНТЕЗ

По характеру энергетического обеспечения все живые организмы, обитающие на нашей планете, подразделяются на:

· автотрофные;

· гетеротрофные.

Первые самостоятельно усваивают энергию, вторые – получают ее в процессе катаболизма экзогенных продуктов (пищевых веществ, поступающих извне).

Особое место среди аутотрофов занимают фотосинтезирующие организмы. Они усваивают солнечную энергию и запасают ее в форме АТФ и восстановленного НАДФ, которые в дальнейшем используются для синтеза углеводов. Этот процесс сопровождается выделением молекулярного кислорода в атмосферу, что обеспечивает поддержание жизни аэробных организмов. Образовавшиеся в процессе фотосинтеза углеводы далее могут окисляться гетеротрофными организмами, за счет чего эти организмы обеспечивают себя энергией.

Таким образом, в природе существует тесная взаимосвязь и строгий баланс между гетеротрофами и аутотрофами (рис. 76).

Фотосинтез характерен для растений. Он происходит как в высших, так и низших растениях (водоросли, лишайники, цианобактерии и др.). Различия в его течении заключаются лишь в том, выделяется ли в процессе фотосинтеза кислород или нет: у высших растений и цианобактерий он выделяется, у серных бактерий – нет.

Рисунок 76 – Взаимосвязь между гетеротрофными и

аутотрофными организмами

Процесс фотосинтеза происходит в особых внутриклеточных органеллах – хлоропластах. Хлоропласты представляют собой гранулярные внутриклеточные структуры, окруженные наружной и внутренней мембранами (рис. 77).

Хлоропласт ограничен двумя мембранами – наружной и внутренней. Пространство, ограниченное внутренней мембраной заполнено стромой. В строме находятся тилакоидные пузырьки, связанные друг с другом в стопки – граны. Отдельные граны объединены друг с другом при помощи ламелл.Внутренняя мембрана ограничивает внутренний отсек (компартмент) хлоропласта. В нем имеется большое количество мембранных мешочков и пузырьков – тилакоидов, которые связаны друг с другом в стопки – граны. В тилакоидах содержатся фотосинтетические пигменты и ферменты, принимающие участие в фотосинтезе. Ферменты, участвующие в синтезе углеводов в темновых реакциях фотосинтеза, находятся в растворимом содержимом хлоропласта – строме. Граны связаны друг с другом с помощью мембранных структур – ламелл. У некоторых видов растительных организмов отдельные реакции фотосинтеза могут происходить прямо в цитозоле клеток.

Рисунок 77 – Схема строения хлоропласта

В качестве световоспринимающего элемента в хлоропластах используется зеленый пигмент – хлорофилл, каротиноиды и фикобилины. В растительных клетках наиболее широкое распространение получили хлорофиллы а и в, которые различаются по структуре заместителей пиррольных колец. Зеленые растения содержат обе формы хлорофиллов, а бактерии – только особую разновидность хлорофилла а – бактериохлорофилл.

В основе структуры молекулы хлорофилла лежит циклическая структура, состоящая из четырех объединенных пиррольных колец. С ней связана длинная 20-углеродная гидрофобная цепь спирта фитола. Центральные атомы азота пиррольных колец связаны с катионом магния.

Важной особенностью строения хлорофилла является циклическая система сопряженных двойных связей, придающая ему способность поглощать кванты света. Углеводородная (фитоловая) боковая цепь обеспечивает заякоревание пигмента в мембране тилакоида и придает ему своеобразную ориентацию (рис. 78).

В наибольшем количестве в состав хлоропластов входит хлорофилл а. В последние годы установлено, что существуют несколько разновидностей хлорофилла а, которые различаются максимумом поглощения света (680 и 700 нм).

Кроме хлорофилла в состав тилакоидов входят также другие (вспомогательные) пигменты. К ним относятся каротиноиды (имеют оранжевый цвет), ксантофилл (желтый цвет) и др. Эти пигменты с большей эффективностью улавливают свет различных областей спектра. Поэтому они дополняют хлорофиллы как фоточувствительные элементы. В зависимости от соотношения пигментов в растении, их окраска может существенно варьироваться: от зеленой, до желтой и красной.

Рисунок 78 – Строение хлорофилла. R в хлорофилле а

представлен – -СН₃ (метильной) группой,

а в хлорофилле в – -СОН (альдегидной) группой

В тилакоидах светопоглощающие пигменты организованы в функциональные ансамбли – фотосистемы (рис. 79). В состав фотосистем шпината входит около 200 молекул хлорофиллов и около 50 молекул каротиноидов. Эти ансамбли обладают способностью поглощать весь спектр видимого света. Все молекулы пигментов обладают способностью воспринимать кванты видимого света. В то же время только одна молекула в фотосистеме способна трансформировать световую энергию в химическую. Эта молекула представлена молекулой хлорофилла, связанной с особым белком. В целом она представляет собой фотохимический реакционный центр фотосистемы. Все остальные молекулы пигментов в фотосистеме – светособирающие (антенные). Они воспринимают квант света и передают его на фотохимический реакционный центр.

Рисунок 79 – Схема строения фотосистемы листьев растений:

1 – реакционный центр фотосистемы; 2 – молекула каротиноида; 3 – молекула хлорофилла. (Стрелками показан путь передачи энергии кванта поглощенного света на реакционный центр с антенной молекулы хлорофилла)

В тилакоидах высших растений существуют два типа фотосистем. Фотосистема 1 максимально активируется видимым светом с большой длиной волны. Она содержит в своем составе больше хлорофилла а, чем в. Эта система принимает участие в восстановлении НАДФ.

Фотосистема 2 максимально активируется более коротковолновым светом и содержит в своем составе больше хлорофилла в. Она участвует в окислительно-восстановительных превращениях, которые сопровождаются образованием и выделением кислорода. Ее функционирование имеет отношение к продукции молекулярного кислорода из воды.

Фотосинтез происходит в две стадии: световую и темновую. Во время световой фазы осуществляется синтез АТФ, восстановление НАДФ и выделение кислорода, а во время темновой фазы – синтез моносахаридов с участием образованных во время световой фазы АТФ и восстановленного НАДФ.