Методические рекомендации к занятию

При подготовке к занятию необходимы знания техники безопасности при работе с химическими реактивами и правила оказания первой медицинской помощи; знания состава и свойств белков, механизмов осаждения и высаливания белков, основных денатурирующих факторов; умения по вычислению заряда аминокислот в различных средах, суммарного заряда пептидов и белков. При выполнении лабораторного практикума необходимы знания общих качественных реакций на протеиногенные аминокислоты и характерных цветных реакций на отдельные аминокислоты, входящие в состав белков; знания механизмов реакций осаждения белков.

Для лучшего усвоения материала при оформлении работы цветные реакции на белки необходимо сопровождать рисунками с наблюдаемыми в пробирках внешними признаками реакций. В конце работы формулируется вывод.

ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ

I. Приготовление растворов белков для проведения качественных реакций.

А) Приготовление неразбавленного белка куриного яйца.

Б) Приготовление разбавленного раствора куриного альбумина.

Часть 1. Качественные реакции на белки.

1. Биуретова реакция (обнаружение в молекулах белков пептидных связей).

2. Нингидриновая реакция ( на обнаружение α-аминокислот).

3. Ксантопротеиновая реакция.

4. Реакция Вуазене.

5. Реакция Паули.

6.Реакция на «слабосвязанную серу».

Часть 2. Реакции осаждения белков

1. Осаждение белков спиртом

2. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами

3. Осаждение белков органическими кислотами

4. Свертывание белков при нагревании

5. Высаливание белков сульфатом аммония

I. Приготовление растворов белков для проведения качественных реакций

А) Приготовление неразбавленного белка куриного яйца

Отделяют белок трех куриных яиц от желтков. Считая, что масса белка в одном яйце в среднем равна 33г, получают около 100 мл неразбавленного раствора белков куриного яйца. Этот раствор содержит 88% воды, 1 % углеводов и 0,5% минеральных веществ; остальное приходится на белок. Таким образом, полученный не­разбавленный белок куриного яйца представляет собой пример­но 10%-ный раствор белка.

Б) Приготовление разбавленного раствора куриного альбумина

Белок одного куриного яйца после отделения от желтка хорошо взбивают и затем смешивают в колбе при встряхивании с десятикратным объемом дистиллированной воды. Раствор филь­труют через двойной слой смоченной водой марли или кусок стираного полотна, помещенного в воронку. Отфильтровывают раст­вор яичного альбумина; в осадке остается яичный глобулин. Учи­тывая, что концентрация альбумина в белке куриного яйца составляет около 6%, полученный разбавленный раствор яичного альбумина является примерно 0,5%-ным.

II. Качественные реакции на белки

Биуретова реакция

(обнаружение в молекулах белков пептидных связей)

К 1-2 мл разбавленного белка прибавляют двойной объем 30%-ного раствора гидроксида нат­рия, хорошо перемешивают и добавляют 2—3 капли 1%-ного раствора сульфата меди. Снова тщательно перемешивают. Развивается красно-фиолетовое окрашивание. При малом содержании белка чувствительность реакции можно повысить, наслаивая на раствор белка в щелочи 1 мл 1%-ного раствора сульфата меди. При стоянии на границе двух слоев появляется фиолетовое кольцо.

РЕЗУЛЬТАТЫ:

2. Нингидриновая реакция (на обнаружение α-аминокислот)

К 2—3 мл неразбавленного раствора белка приливают 3—4 кап­ли 1%-ного раствора нингидрина в 95%-ном растворе ацетона. Раствор перемешивают и ставят в водяную баню при 70°С на не­сколько минут. Развивается сине-фиолетовое окрашивание.

РЕЗУЛЬТАТЫ:

Ксантопротеиновая реакция

К 1 мл раствора белка добавляют 5—6 капель концентри­рованной азотной кислоты до появления белого осадка или мути от свернувшегося белка. При нагревании раствор и осадок окрашиваются в ярко-желтый цвет. При этом осадок почти полностью растворяется. Охлаждают смесь и осторожно добавляют к раствору, имею­щему кислую реакцию, не взбалтывая, по каплям избыток кон­центрированного гидроксида аммония или щелочи до щелочной реакции. Выпадающий вначале осадок кислотного альбумината растворяется, и жидкость окрашивается в ярко-оранжевый цвет. Ксантопротеиновая реакция происходит только при наличии в белках остатков ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина и триптофана).

РЕЗУЛЬТАТЫ:

Реакция Вуазене

К 2 мл неразбавленного раствора белка в пробирке добавляют одну каплю 2,5%-ного раствора формальдегида. Смешивают и прибавляют 6мл чистой концентрированной соляной кислоты (плотность не менее 1,175), после чего снова перемешивают (можно поставить на водяную баню). Че­рез 10 мин прибавляют при взбалтывании 10 капель 0,5%-ного раствора нитрита натрия. Развивается интенсивное сине-фиолетовое окрашивание. Реакция протекает только с теми белками, которые содержат в своем составе триптофан.

РЕЗУЛЬТАТЫ:

Реакция Паули

К 1 мл 1%-ного раствора сульфаниловой кислоты в 5%-ном растворе соляной кислоты приливают 2мл 0,5%-ного раствора нитрита натрия, сильно встряхивают и немедленно добавляют сначала 2мл разбавленного раствора белка, а затем, после пере­мешивания содержимого пробирки, 6мл 10%-ного раствора кар­боната натрия. После смешивания растворов развивается вишнево-красное окрашивание. Возникновение окраски обусловлено наличием в белковой молекуле остатков гистидина и тирозина.

РЕЗУЛЬТАТЫ:

6.Реакция на «слабосвязанную серу»

В пробирку наливают 0,5—1,0 мл неразбавленного белка, добавляют двойной объем концентрированного раствора щелочи, кладут несколько «кипятильников» и кипятят смесь (осторожно, жидкость может выбросить!). При этом выделяется аммиак, который может быть обнаружен по запаху и по посинению влаж­ной лакмусовой бумажки, поднесенной к отверстию пробирки (не касаться стенки!). Образующийся незначительный осадок растворяется при кипячении. Горячую щелочную жидкость делят на 2 части:

- к первой при­ливают раствор плюмбита натрия, образуется желто-бурое или черное окрашивание. Плюмбит натрия получается при смешивании растворов растворимых солей свинца (Pb(CH₃COO)₂ или Pb(NO₃)₂) с избытком NaOH. Сначала при постепенном прибавлении NaOH выпадает осадок, который при дальнейшем приливании NaOH растворяется.

- ко второй добавляют 2-3 капли свежеприготовлен­ного разбавленного раствора нитропруссида натрия, получается красно-фиолетовое окрашивание.

При наличии в молекуле белка аминокислот, содержащих серу (цистина, цистеина), от этих аминокислот постепенно отщепляется также и сера в виде иона в степени окисления +2. Его образование можно обнаружить с помощью ионов тяжелых металлов, например ионов свинца, образующих с ионами серы черный нерастворимый суль­фид свинца: Pb²⁺ + S^2- → PbS

РЕЗУЛЬТАТЫ: