Лабораторно-практическое занятие. «Физико-химические свойства ферментов»

«Физико-химические свойства ферментов»

Цель работы: ознакомиться с каталитической функцией ферментов, изучить основные физико-химические свойства ферментов на примере амилазы слюны.

Оборудование: штатив с пробирками, водяная баня, термометр, стеклянные палочки, предметные стекла, секундомер, термостат, химические стаканы, спиртовка, держатели для пробирок, универсальная индикаторная бумага.

Реактивы: 0,5%-ный и 1%-ный раствор крахмала, раствор Люголя, 1/15М дигидрофосфат калия, 1/15М гидрофосфат натрия, 1% раствор сахарозы, 10%-ный раствор гидроксида натрия, 1%-ный раствор сульфата меди, дистиллированная вода, 1%-ный раствор хлорида натрия, йод в иодиде калия, раствора ляписа АgNO₃, конц. уксусная и азотная кислоты, 3%-ный раствор хлорида железа (III) FeCl₃, конц. раствор гидроксида натрия или аммония, 2М раствор соляной кислоты.

Материалы: слюна.

Методические рекомендации к занятию

При подготовке к занятию необходимы знания об особенностях строения, классификации, физико-химических свойствах ферментов, участия ферментов в переваривании пищи. При выполнении лабораторного практикума нужны знания качественных реакций на йод, влияния температуры, рН среды, активаторов и ингибиторов на свойства ферментов.

ЛАБОРАТОРНЫЙ ПРАКТИКУМ

Часть 1. Изучение физико-химических свойств ферментов на примере амилазы слюны

1. Влияние температуры на активность ферментов.

2. Влияние рН среды на активность амилазы слюны.

3. Специфичность ферментов.

1. Влияние активаторов и ингибиторов на активность ферментов.

Часть 2. Исследование химического состава слюны

1. Обнаружение анионов неорганических кислот.

2. Обнаружение муцина и изучение его природы.

Часть 1. Изучение физико-химических свойств ферментов на примере амилазы слюны

Будучи по своей химической природе белками, ферменты обладают всеми свойствами белков: термолабильностью, амфотерностью, способностью образовывать коллоидные растворы и т. д. Кроме того, им присущи характерные только для них свойства: высокая специфичность, действие при определенном значении рН среды и др.

Влияние температуры на активность ферментов

1. В 4 пробирки отмерить по 2 мл крахмала. Пробирки поместить в разные температурные условия:

а) в кипящую водяную баню 100^оС

б) в термостат на 40 ^оС

в) оставить в штативе (комнатная температура)

г) поставить в снег.

3. Через 10 мин, когда содержимое пробирок примет заданную температуру, во все пробирки добавляют по 0,5мл разбавленной слюны, перемешивают с помощью стеклянной палочки и оставляют в тех же условиях.

4. Тотчас же начинают делать капельные пробы на стекле. Две капли содержимого второй пробирки капают на стекло, к ним добавляют 1 каплю раствора Люголя. Вначале получается синее окрашивание, через 1-2 мин. пробу повторяют до появления красно-бурой окраски.

4.Как только окраска содержимого второй пробирки окажется красно-бурой, прибавляют во все пробирки 1-2 капли раствора Люголя и отмечают время окончания ферментативной реакции.

После проведения опыта все пробирки переносятся в штатив и записывают результаты опыта.

Схема записи протокола опыта

Влияние рН среды на активность амилазы слюны

Содержимое каждой пробирки после прибавления слюны тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре (20^оС) на 15-20 мин. Через 10 мин. берут пробы из третьей пробирки, переносят на стеклышко и проделывают реакцию с каплями раствора Люголя. Вначале обычно получается синее окрашивание, затем фиолетовое, фиолетово-красное, красно-бурое, желтое. Как только содержимое третьей пробирки будет давать желтое окрашивание, через 1-2 минуты приливают во все пробирки по 1 капле раствора Люголя.

На основании полученной окраски судят о степени расщепления крахмала в зависимости от рН среды.

Схема записи протокола опыта

Специфичность ферментов

Принцип работы: каждый фермент может катализировать только одну реакцию, действуя на одно вещество или ряд близко родственных веществ. Высокая специфичность - одно из наиболее характерных свойств ферментов. Амилаза слюны ускоряет гидролиз только полисахаридов и не оказывает никакого действия на дисахариды. В случае расщепления сахарозы на глюкозу и фруктозу реакция Троммера должна быть положительной. При расщеплении крахмала до глюкозы эта проба также положительна.

Работа проводится с 2 пробирками по следующей схеме: в каждую из пробирок добавляют по 0,5 мл слюны, затем в 1-ю - 2 мл крахмала, во 2-ю – 2 мл сахарозы, оставляют на 10 минут.. Содержимое каждой пробирки делят на 2 части: одну часть проверяют с раствором Люголя, другую – с раствором Троммера. на присутствие глюкозы:

1 мл исследуемого раствора + 0,5 мл 10% раствора гидроксида натрия + 5 капель 1% раствора сульфата меди.

Пробирку нагревают в кипящей водяной бане. При наличии глюкозы появляется желтое окрашивание, переходящее в красное.