Кинетика ферментативных реакций

Скорость ферментативных реакций зависит от концентрации суб-

страта. Эта зависимость носит сложный характер, который для определенных ферментов описывается параболической кривой (рис. 29).

Рисунок 29 – Зависимость скорости ферментативной реакции

от концентрации субстрата

Параболический характер зависимости объясняется тем, что при взаимодействии фермента с субстратом происходит образование фермент-субстратного комплекса. Первоначально при увеличении концентрации субстрата происходит возрастание концентрации фермент-субстратных комплексов в реакционной смеси, что проявляется в параллельном повышении скорости реакции. При определенной концентрации субстрата (насыщающей) возникает своеобразное “насышение” всех активных центров молекул ферментов в реакционной смеси. Скорость ферментативной реакции при насыщающей концентрации становится максимальной. При дальнейшем повышении содержания субстрата в реакционной смеси она не изменяется.

Из графика зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата вычисляются два важных показателя:

1. Максимальная скорость реакции (V_max). Она определяется как скорость реакции при насыщающей концентрации субстрата. Величина макси-мальной скорости отражает каталитическую мощность фермента. Ферменты, обладающие большей величиной V_max, являются более мощными катализаторами. В единицу времени они катализируют превращение большего количества молекул субстрата. Величина максимальной скорос-ти выражается числом оборотов фермента. Число оборотов оценивается количеством молекул субстрата, превращаемых ферментом в единицу времени (с^-1). Для большинства ферментов число оборотов находится в пределах 10⁴. В тоже время существуют ферменты, для которых число оборотов значительно больше (600000 – для карбангидразы) или меньше этой величины (100 – для химотрипсина).

2. Константа Михаэлиса (К_м). Константа Михаэлиса представляет собой концентрацию субстрата, при которой скорость реакции составляет половину максимальной. Величина К_м отражает сродство фермента к суб-страту. Чем больше эта величина, тем меньшее сродство к субстрату имеет фермент. К_м выражается в молях субстрата. Так, величина К_м по отношению к глюкозе у фермента глюкокиназы составляет 10 ммоль, а для гексокиназы – 0,01 ммоль. Гексокиназа проявляет большее сродство к глюкозе, чем глюкокиназа, при одинаковой концентрации субстрата она с большей скоростью катализирует фосфорилирование глюкозы.

На основании математического анализа кривой зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата Л. Михаэлисом и М. Ментен (1913) была выведена формула, позволяющая оценить взаимоотношение между скоростью реакции, максимальной скоростью и константой Михаэлиса. В настоящее время она определяется как уравнение Михаэлиса – Ментен.

V_o = V_max [S]/K_м + [S],

где V_o – скорость реакции, S – концентрация субстрата.

Общие свойства ферментов

Несмотря на существование определенных различий в строении, функции и внутриклеточной локализации, для ферментов характерен целый ряд общих свойств. К таковым относятся зависимость проявления их каталитической активности от температуры (термолабильность) и рН среды, а также субстратная специфичность.

Характерным свойством ферментов является термолабильность. Это явление может быть проиллюстрировано графиком зависимости скорости ферментативной реакции от температуры реакционной смеси (рис. 30).

Рисунок 30 – Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры

реакционной среды (t_опт – оптимальная температура; V – скорость реакции)

Как видно из представленного графика при температуре, близкой к 4 ^оС ферментативные реакции практически не идут. По этой причине биологические объекты могут определенное время храниться перед проведением биохимических исследований на холоде. Именно холод позволяет сохранять пищевые продукты от аутолиза (самопереваривания).

Повышение температуры сопровождается повышением скорости ферментативной реакции. Причиной этого является повышение кинетичес-кой энергии молекул субстрата и фермента, способствующее повышению скорости взаимодействия между ними. Подобное явление наблюдается до температуры, которая соответствует температурному оптимуму фермента. Температурный оптимум фермента соответствует той температуре, при которой скорость ферментативной реакции максимальна. Для ферментов теплокровных животных оно обычно составляет 28 ^оС или 37 ^оС.

Дальнейшее повышение температуры реакционной смеси приводит к постепенному понижению скорости ферментативной реакции. Это явление обусловлено процессом термоденатурации полипептидной цепи белка. Денатурация сопровождается изменением структуры активного центра фермента, следствием чего и становится понижение сродства фермента к суб-страту. При температуре выше 55 ^оС большинство ферментов полностью утрачивает каталитические свойства (инактивируется). В этой связи прогревание до 55–56 ^оС широко используется для процедуры пастеризации, которая повышает срок хранения пищевых продуктов (молока и др.).

Большое влияние на скорость ферментативной реакции оказывает рН среды. Как видно из представленного на рис. 31 графика, он напоминает по форме график зависимости скорости ферментативной реакции от температуры.

Рисунок 31 – Зависимость скорости (V) ферментативной реакции

от рН среды (рН_опт – рН оптимум фермента)

Резкое снижение скорости ферментативной реакции при экстремальных значениях рН связано с явлением денатурации полипептидной цепи белковой молекулы под действием кислот и щелочей. Фермент проявляет максимальную каталитическую мощность при величине рН, которая определяется термином рН-оптимум фермента. Большинство известных ферментов имеет оптимум рН в области от 5,0 до 7,5. Вместе с тем существует немало примеров ферментов, у которых величина рН-оптимума смещена в область кислых или щелочных значений рН. К таким ферментам относятся:

Причина существования зависимости скорости ферментативных реакций от рН связана с тем, что величина рН среды оказывает выраженное влияние на степень ионизации функциональных групп субстрата. Особенности ионизации молекулы янтарной кислоты при различной кислотности среды (рН):

Одновременно рН среды оказывает влияние и на степень ионизации аминокислотных радикалов, входящих в состав активного центра фермента:

Если образование фермент-субстратного комплекса стабилизируется за счет электростатических взаимодействий, то становится понятной роль рН в обеспечении оптимальных условий для течения ферментативной реакции (рис. 24).

Скорость реакций катализируемых ферментами, во взаимодействии которых с субстратами не имеют существенного значения электростали-ческие взаимодействия, в меньшей мере зависит от рН среды. На рис. 32 представлена зависимость скорости гидролиза белков папаином. Во взаимодействии этого фермента с субстратом основное значение приобретают гидрофобные взаимодействия. Как видно из представленного графика, у папаина вообще отсутствует четко выраженный рН-оптимум.

Рисунок 32 – Влияние рН на скорость гидролиза белка папаином.

Ферменты обладают определенной специфичностью в отношении субстратов. Под специфичностью подразумевается свойство ферментов катализировать превращение одного или группы сходных по строению субстратов. Существует несколько видов специфичности ферментов.

· Абсолютная специфичность. Под ней подразумевается способность фермента катализировать превращение только одного субстрата. К ферментам, обладающим абсолютной специфичностью, относятся аргиназа, уриказа рестриктазы и др.

· Относительная специфичность. Под ней подразумевается способность фермента катализировать превращение группы сходных по строению субстратов (т.н. протеолитические ферменты гидролизуют различные белки, липаза сложные эфиры глицерина и высших жирных кис-лот, гексокиназа фосфорилирует разные моносахариды). При этом специфичность определяется тем, что фермент оказывает влияние только на определенный тип связи (протеолитические ферменты гидролизуют пептидную связь, липаза гидролизует сложную эфирную связь и т.д.).

· Стереоспецифичность. Под этим термином подразумевается свойство фермента катализировать превращение одного стереоизомера субстрата. Так, ферменты, участвующие в превращении моносахаридов, проявляют специфичность по отношению к их D-стереоизомерам, а ферменты, участвующие в превращении аминокислот, – к их L-стерео-изомерам.

Активность ферментов

Особенностью ферментов как катализаторов является то, что они под действием разных внешних факторов способны изменять свои каталитические свойства. Мерой проявления силы каталитического действия ферментов является их активность. Способность ферментов менять свою активность в различных условиях имеет большой биологический смысл. Это свойство позволяет живой клетке приспосабливать состояние обменных процессов под сиюминутные потребности клеток, которые могут существенно изменяться под влиянием различных внешний факторов.

Определение активности ферментов играет важную роль их характеристике. Существуют некоторые общие принципы количественного определения активности ферментов. Активность ферментов можно определять так:

· либо по скорости накопления в реакционной смеси, где находится фермент продукта реакции;

· либо по скорости исчезновения из реакционной смеси субстрата ферментативной реакции.

Оба эти подхода равнозначны и могут быть использованы на практике. Однако при определении активности фермента необходимо соблюдать следующие условия: в реакционной смеси, в которой проводится определение активности фермента,

· температура должна соответствовать температурному оптимуму данного фермента;

· рН среды должна соответствовать рН-оптимуму данного фермента;

· концентрация субстрата должна быть не меньше насыщающей;

· должны присутствовать кофакторы, если таковые у этого фермента существуют;

· должны присутствовать активаторы фермента.

Таким образом, активность фермента определяется в оптимальных для него условиях. В этих условиях активность фермента пропорциональна его содержанию в исследуемом образце и поэтому может использоваться для косвенной оценки его концентрации.

Активность фермента количественно выражается в единицах активности. За одну единицу активности фермента (ЕД) принимается активность фермента, при которой под его влиянием происходит образование 1 мкмоль продукта реакции (или исчезновение 1 мкмоль суб-страта) в минуту. В системе СИ за единицу ферментативной активности принят катал (кат). 1 катал соответствует активности фермента, при которой происходит образование одного моля продукта реакции (исчезновение одного моля субстрата) за секунду.

Для характеристики ферментов используют также величину удельной активности. Эта единица отражает активность фермента в расчете на единицу его массы и выражается в мкмоль/мин мг белка. Единицы удельной активности используют для оценки чистоты ферментных препаратов. Чем выше величина удельной активности, тем чище ферментный препарат.